文档介绍：第三章基因克隆载体第一节载体的功能及其特征载体:携带外源 DNA 进入宿主细胞的工具。一、载体的功能 1. 运送外源基因高效转入受体细胞 2. 为外源基因提供复制能力或整合能力 3. 为外源基因的扩增或表达提供条件二、载体应具备的条件 1. 具有对受体细胞的可转移性 2. 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 3. 长度尽可能小,以提高其载装能力 4. 具有多种单一的酶切位点 5. 具有合适的选择性标记附图: 图 3-1 自主复制型载体和附加载体的扩增方式第二节质粒质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链 DNA 分子( Covalently closed Circular DNA, ccc DNA ),并不是细菌生长所必需的,但可以赋予细菌某些抵御外界环境因素不利影响的能力。分子量在 1-200kb 之间。一、质粒的基本特性(一)自主复制性质粒 DNA 携带有自己的复制起始区( ori )以及一个控制质粒拷贝数的基因,因此它能独立于宿主细胞的染色体 DNA 而自主复制。不同的质粒在宿主细胞内的拷贝数也不同, 少则几个多则几百个不等,当然由于质粒上并没有复制酶的基因,所以其复制需要使用宿主细胞复制染色体 DNA 的多种酶群。(二)不相容性利用同一复制系统的不同质粒( RNAI RNAII Rop 因子)如果被导入同一细胞中,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中, 就会彼此竞争, 它们在单细胞中的拷贝数也会有差异, 拷贝多的复制更快, 结果在细菌繁殖几代之后, 细菌的子细胞中绝大多数都含有占优势的质粒, 因而这两种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中,这就是所谓的质粒不相容性。(三)可扩增性质粒就其复制方式而言分为两类:松弛型复制及严谨型复制。 pMB1 或 ColEI 类质粒复制子的复制完全依靠宿主细胞提供的半衰期较长的复制酶及蛋白因子( DNA 聚合酶 I, III , RNA 聚合酶以及 dnaB 、 dnaC 、 dnaD 、 dnaZ 的产物),因此在蛋白质合成中断时,质粒复制能持续合成, 这样当用***霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时,带有 pMB1 或 ColEI 复制子的质粒将利用丰富的原料大量复制,最后每个细胞可以积聚 2000-3000 个拷贝,这叫做***霉素扩增。但另外两种质粒( psc101 和 p15A )和的复制子的复制受质粒上编码的蛋白因子的正调节。***霉素抑制蛋白质合成后,这类质粒便不能持续复制。(四)可转移性在天然条件下, 很多天然质粒都可以通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内,这种转移依赖于质粒上的 tra 基因产物。二、质粒的构建(一)天然存在的两种质粒(1) colE1 宿主细菌大肠杆菌 松弛型复制 20-30/cell (2) pSC101 宿主细菌沙门氏菌 严谨型复制 5copy/cell 标记基因为 Tcr 质粒的命名 p 小写代表质粒;后面有两至三个大写字母代表发现者或构建者的姓名。(二) 质粒人工构建的目的天然质粒往往存在着这样或那样的缺陷, 因而不适合用作基因工程的载体必须对之进行改造构建: (1 )加入合适的选择标记基因,如两个以上,易于用作选择(2 )增加或减少合适的酶切位点,便于重组(3 )缩短长度,切去不必要的片段,提高导入效率,增加装载量(4 )改变复制子,变严紧为松弛,变少拷贝为多拷贝(5 )根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件方法就是重组,拼拼接接,挖肉补疮。三、质粒的分类(一)根据质粒基因编码的特性将质粒分为五大类: Fertility /F 质粒:只含有 tra 基因,除了促进接合转移外没有其他功能。 Resistance /R 质粒: 含有***霉素、青霉素或水银抗性基因。如 RP4 , 发现于假单胞杆菌。 Col 质粒:编码大肠菌素,可以杀死其他细菌,如存在于 E. coli 中的 CoE1 。图 3-2 利用抗性基因进行重组子的筛选降解质粒( Degradative plasmids ): 可以降解特殊的分子如:甲苯,水杨酸。致瘤质粒( Virulence plasmids )农杆菌 Ti 质粒(二)人工构建的质粒根据其功能及用途分为: 1. 多拷贝质粒复制子经过人工突变,除去控制拷贝数负调节基因,使质粒拷贝数达到每个细胞数千,用于扩增外源基因。 2. 测序质粒 3. 整合质粒装有整合促进基因及整合特异序列,便于外源基因准确重组整合入受体细胞的染色体上 4. 穿梭质粒含有两个不同的复制子,能在两种不同的受体细胞中复制 5. 表达质粒装有强的启动基因,合适的顺序以及有效的终止子,以便任何外源基因在受体细胞内的高效表达 6. 探针质粒筛选克隆或寻找基因元件,通常装有一个可以定量测定其