文档介绍：宏基因组文库构建威斯腾生物技术中心 400-675-6758 什么是文库? ? Library ?基因文库(也称 DNA 文库)是指某一生物体全部或部分基因的集合, 就像一个没有目录的“基因图书馆”?基因文库的组成: 外源 DNA 片段:研究对象基因组 DNA 或 cDNA 载体:质粒载体( plasmid )、黏粒载体( cosmid )、人工染色体( BAC 、 YAC )等宿主:大肠杆菌( )、酵母( haromyces cerevisiae ) 1976 年 , 提出了一个完全的基因文库所需克隆的计算公式 n=ln(1-p)/ln(1-f) n: 一个完全基因文库所应包含的重组体克隆数 p: 所期望的目的基因在基因文库中出现的几率 f: 插入片段的平均大小与基因组 DNA 大小的比值哺乳动物 3 × 10 9kb 若 p=99% 平均克隆片段 20kb f=20kb/3 × 10 9 n= 4639221bp p=99% f=20kb/4600kb n= p=99% f=10kb/4600kb n=2116 若这些大量的重组 DNA 分子所含的外源 DNA 不是基因组 DNA ,而是由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA 经反转录形成的 cDNA ,它们所构成的重组 DNA 克隆群体,则称之为 cDNA 基因文库 cDNA 文库:可装载的外源 DNA Plasmid <10kb λ Phage 0-23kb Cosmid ~45kb BAC ~ 100kb YAC ~ 300kb- 载体的选择: 粘粒克隆所需的克隆子数是λ phage 的一半, 如λ需 700000 时, cosmid 需 350000 个如无特殊需要(如单个λ phage 不能包容靶基因片段或要分离一系列跨过染色体 DNA 特大区段的重叠克隆时)一般不采用 cosmid ,因其在构建文库和贮存文库比λ phage 困难得多 YAC 可用于克隆 500kb 以上,甚至几 Mb 的 DNA 片段 BAC 可减少 DNA 分子间的重组基因克隆的策略基因克隆的本质从文库中筛选目标克隆,重点在“筛选”常见筛选工具: 探针狭义: 核酸, 抗体广义: 还包括其他筛选手段?抗性基因: antibiotics 抗性基因, 抗重金属活性一、功能筛选?分解基因: 苯环化合物, 分解酶?功能活性:杀虫,酶?启动子/复制子利用目标基因的特定功能进行筛选