文档介绍：中山大学
博士学位论文
胚胎干细胞源性表皮干细胞构建组织工程皮肤的研究
姓名:刘爱军
申请学位级别:博士
专业:人体解剖与组织胚胎学
指导教师:李海标
20050508
胚胎干细胞源性表皮干细胞构建组织工程皮肤的研究博士研究生刘爱军师李海标教授中山大学基础医学院组织胚胎学教研室中文摘要导缺乏皮肤附属结构,如汗腺、毛囊、皮脂腺等。本研究着重探讨以下问题:①建组织工程皮肤的条件;③该人工皮肤植入同种小鼠皮下的分化潜能;④该人工干细胞是单个或成群存在的细胞,它既能产生子代细胞,又能自身增殖。干细胞可分为:胚胎性干细胞统商甯细胞。胚胎性干细胞包括来自胚泡内细胞群的胚胎干细胞珽赴、来自原始生殖细胞的胚胎生殖细胞珽赴和来自畸胎瘤的胚胎癌细胞细胞3商甯上赴谴嬖谟谝逊只蛱鼗橹械母上赴煅F鞴俟撬柚校除造血干细胞外,还存在有间质干细胞胚胎干细胞具有发育全能性和无限增殖的潜能,在~定条件下可定向分化为来源于三个胚层的各种类型的细胞,其中包括造血细胞、内皮细胞、神经细胞及心肌细胞等。骨髓中含量极少,但增殖能力非常强,随传代次数增多,增殖能力下降,分化能力并无明显改变。我们先前的研究表明人羊膜可定向诱导细胞分化为表皮千细胞,后者具有分化为表皮及皮肤附属结构的潜能。目前组织工程皮肤多以角质形成细胞作为种子细胞,植入体内只能形成表皮和真皮,细胞源性表皮干细胞在不同微环境中的分化潜能;⑦细胞源性表皮干细胞构皮肤植入去皮小鼠后,能否存活和生长浔砻婺芊穹只纬杀砥在人工真皮内能否形成皮肤附属结构莸ザ繣噆赴葱员砥じ上赴踩肴テば∈竽芊穹甅。刘爱军博十论文胚胎干细胞源性表皮千细胞构建组织工程皮肤的研究摘要珽
第一部分对胚胎干细胞增殖的影响及细胞源性表皮干细胞分化潜能的研究化形成表皮及皮肤附属结构狙芯课2鱁赴葱员砥じ上赴只奶跫和调控机理,及为具有皮肤附属结构的组织工程化皮肤提供新的种子细胞奠定基咛ジ上赴葱员砥じ上刚霸谏霰荒一栈肪持蟹仲G蹦艿难芯结果:小鼠胚胎干细胞源性表皮干细胞在∈笊霰荒夷7只S础。本研究包括以下四个部分:对小鼠细胞增殖的影响方法:将∈笈咛ジ上赴直鹋嘌诤琇疞及含痬峙ǘ鹊腷腅赴∨嘌褐校鄄煜赴翁计数细胞克隆数。行碱性磷酸酶托∈罂谷肱咛ソ锥翁匾煨钥乖璉琒狪タ寺】固迦旧ḿ痬嘌的细胞。结果:痬培养的细胞生长较缓慢,克隆周边可见较多的分化细胞,后细胞克隆数为;/和/与含疞培养的细胞形态相似,后细胞克隆数分#±,。方法:∈驟胚胎干细胞与人羊膜共培养ㄏ蛴盏计浞只3纤亍和阳性的表皮样干细胞克隆,无菌手术下移植入小鼠双侧肾被囊内,术后〔摹6砸浦埠笙赴姆只榭鼋形态学和免疫组织化学观察。单层或复层上皮样细胞构成的管状和泡状结构,种植鲜鼋峁雇猓可见角化复层扁平上皮、汗腺样、皮脂腺样及毛囊样等结构。免疫组化汗腺样结构里虲粜浴士和刘爱军博上论文胚胎干细胞源性表皮干细胞构建组织程皮肤的研究摘要/、/
第二部分碱性成纤维细胞生长因子对丈鼠骨髓闻质千细胞增殖第三部分真皮支架材料的组织相容性研究第四部分细胞源性表皮干细胞为种子细胞构建组织工程皮肤和体内移植研究的影响方法:标记瓻赴蚰び盏螅纬杀砥じ上赴方法:用冲洗骨髓腔,收集骨髓细胞悬液,接种在塑料培养瓶中,经体外扩增、纯化,观察其生长特性,用免疫组织化学法检测波形蛋白和纤粘连蛋白的表达,并研究不同浓度对骨髓生长曲线和克隆形成率的影响。结果:原代培养时形成由基质干细胞组成的细胞集落,细胞集落苯咏融合,传代后细胞体积变大,约ù次;免疫组化显示骨髓呈波形蛋白阳性,而纤粘连蛋白阴性。浓度/和/组的骨髓的细胞数和克隆形成率比痬楹投哉兆无飨栽黾樱哂高度显著性,方法:将胶原、硫酸软骨素、透明质酸和甲壳糖按一定比例溶解,制备成复合凝胶,连同胶原海绵、明胶海绵三种真皮支架材料埋植入∈笃は拢鹾、、〔模翁Ч鄄觳牧显谔迥诘姆从Α⒀9化进程和降解速度等,评价其组织相容性。结果:复合凝胶和胶原海绵体内引起轻微的炎症反应,以刨伤性修复为特征,约降解。明胶海绵的组织反应以粆喊拖赴途奘上赴笪V鳎到庵芷谠。三种材料均易被宿主成纤维细胞侵入,易于血管化。细胞源性表皮干细胞与类真皮组成皮肤类似物在皮下的分化刘爱军磷士论文胚胎干细胞源性表皮干细胞掏建缨织工程皮肤的研究摘要
骨髓,与复合凝胶一明胶海绵复合,形成皮肤类似物,埋植于∈笃细胞源性表皮干细照对小鼠全层皮肤缺掼修复的研究克隆,并以其作为种子细胞,分别取代ナ蟪上宋赴~笫下。术后、、、取材,做染色观察,纤亍卧、免疫组化荧光双标和免疫组化观察。结果:术后、,植块中以形成单层立方或柱状上皮构成的管状和泡状结构为主,可见复层上皮。、后,除上述结构外,可见角化复层上皮、毛囊样、汗腺样、皮脂腺样等结构,免疫双标结果显示,植入、,带有蓝色核标记的细胞形成的管状或泡状结构呈纤