文档介绍：临床免疫和免疫检验实验指导 23 (一)免疫血清的制备与鉴定实验一、免疫血清的制备机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产生体液免疫(抗体)和细胞免疫(致敏的 T 淋巴细胞及其产物多种淋巴因子)的过程。一种抗原能否引起免疫反应, 一方面取决于抗原分子表面有无特异性的抗原决定簇。另一方面取决于机体有无相应的免疫活性细胞。上述条件具备时, 抗原经合适途径, 选择合适剂量及次数, 进入机体内, 经过一段潜伏期,抗体水平就逐渐升高,维持高峰,既高效价抗体。利用此原理可制备血清学试验所需的抗血清、各种免疫球蛋白及溶血素等。制备优质的免疫血清除需要纯化抗原外,还需注意选择合适的动物及注射的途径, 抗原剂量、注射次数等有密切关系。(一) 抗原制备和动物的选择 1. 抗原的制备: 为了制备特异性强、亲和力高和效价满意的抗血清, 首先要选择合适的抗原。抗原的特异性除与其分子量大小有关外, 还与其分子表面上决定簇性质、位置、立体构型有密切的关系。抗原种类可分为天然抗原、人工抗原及合成抗原。在天然抗原中又可分为可溶性抗原(如血清、***、组织浸出液等) 、颗粒性抗原(如细菌、红细胞等)及半抗原(本身无免疫原性,必须与载体结合才有免疫原性)。 2. 动物的选择:实验室多选用家兔、豚鼠(或鸡) ,商品性生产多用马、羊,特殊情况选用猴。在免疫前应预先测定体内有无存在低滴度交叉反应的天然抗体。(二) 抗原的注射途径和剂量 1. 注射抗原的途径:通常可采用静脉、腹腔或皮下途径,皮内或肌肉途径较少采用。近期发展在局部淋巴结或足等部位注射抗原。不同途径,抗原在体内代谢速度不同, 因而产生抗体的水平不同。在皮下组织中能长期贮留的抗原, 特别是与佐剂相混合的抗原,可以从皮下组织内缓慢释放出来,有利于抗体的产生。 2. 抗原剂量及注射次数:应随抗原的性质而异。 3. 每次注射间隔时间: 不同抗原和不同免疫方法, 可从数日到数周, 一般无佐剂抗原为 2~4 天。加佐剂抗原为 10~15 天。(三) 佐剂的作用原理及种类: 1. 原理:佐剂又称免疫增强剂。它可以增强抗原的免疫原性及改变机体的免疫反应性, 达到增强免疫力或提高抗体产生水平及在体内维持时间明显延长。 2. 种类:通常多用福氏佐剂( Freund adju v ant ) ,它分为福氏不完全佐剂( plete Freund adju v ant )和福氏完全佐剂( Complete Freund adju v ant ) 。福氏不完全佐剂既抗原水溶液( 1~5 mg/ml )1 ml 、油剂(液体石蜡) 4 ml 、乳化剂(羊毛脂) 1g 混合而成 4 油和水的乳悬液。福氏完全佐剂在上述成份中按 10 mg/ml 加入卡介苗。 3. 配制方法: 先将羊毛脂与液体石蜡混合分装小瓶, 高压蒸汽灭菌,8磅 20 分钟,保存 4℃冰箱, 使用前再溶化, 制备可分研磨法和注射法。前者将乳悬液在微火上溶化后, 按比例加入卡介苗, 边滴边研磨, 使菌体完全分散, 按同法加抗原, 每加 1 滴应研磨数转直至小滴消失,加抗原要慢,待抗原全部滴入后则成乳白色粘稠的油包水乳剂。后者将等量的乳悬液和抗原卡介苗混合液分别吸入两个附有针头的 5 毫升注射器内。将其之一与约长 6 厘米的塑料管连接, 针头穿入约 1 厘米, 然后稍稍推动针管, 使液体进入塑料管直至距塑料管开口端还有 1 厘米距离为止, 同时由另一人将另一个 5毫升注射器与塑料管开口端相连, 此时二人相对而坐, 左手固定针头与注射器的连接处, 右手交替推动针管,反复操作,直至形成粘稠的乳剂为止。制成的乳剂是否油包水乳剂, 直接影响到免疫的效果, 因此每次制成后要进行检查。方法是将佐剂抗原滴入冷水表面,滴入后应保持完整而不分散,若滴入后分散,说明不合格,要另行配制。(四) 免疫的方法: 1. 无佐剂免疫法: 应根据抗原的性质采用合理方法。颗粒性抗原( 红细胞、细菌) 通常不需采用加佐剂方法。将某种抗原(浓度约 1% )根据下列的顺序、每次间隔 3~5 天免疫动物(兔) 皮下注入抗原 ml 肌肉 ml ml 静脉(耳) ml 皮内 ml 于最后一次注射后 7 天,采耳血,分离血清,用特异抗原测定其效价。 2. 福氏佐剂免疫法: 1) 一般免疫方法: 第一针剂量为每只家兔注射 1 毫升加佐剂的抗原。注射途径为两只后足掌,每只 毫升,其他各淋巴结附近部位,多点皮内注射。总量为 毫升。第二针间隔在第一针免疫后 3~4 周。剂量为不加佐剂的抗原 1 毫升。注射途径为背部多点皮下注射。第三针间隔时间为第二针免疫后 1~2 周,剂量和途径同第二针。 2) 淋巴结免疫法,卡介苗致敏:每只兔后足各注射活卡介苗( 75 mg/ml )0