文档介绍：中国农业科学院硕士学位论文柔嫩艾美耳球虫表面抗原基因sag13和sag14的克隆与原核表达研究姓名:陈静申请学位级别:硕士专业:动物营养与饲料科学指导教师:丁宏标 20080601 摘要由艾美耳属球虫引发的鸡球虫病是严重危害养禽业的一种寄生虫病,长期以来的化学药物防治使球虫不断产生了抗药性,同时引发了动物源性食品的药物残留问题。采用强毒活苗和致弱疫苗接种预防鸡球虫病不失为一种手段。但由于活苗安全性较差、有效储存期短、不利于大规模生产等问题,促使人们开始研制新型疫苗——基因工程苗和/或核酸疫苗。因其可诱导产生较强的免疫保护反应等优点而倍受青睐。目前的研究焦点多集中在球虫入侵相关蛋白上,主要包括表面抗原以及各类微线体、棒状体、折射体等分泌型亚细胞器抗原,其中柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella) 表面锚定(GPI)抗原SAGl3、SAGl4在子孢子和裂殖子阶段均有表达。但有关表面抗原的生物学性质仍不很清楚。本试验克隆出抗原基因sagl3,sa914并在原核中得以表达,为今后基因工程疫苗的研究提供了一定的基础。(1)基因sagl3,, sagl4基因序列设计特异性引物,用RT-PCR方法克隆了不含N端疏水信号肽序列的柔嫩艾美耳球虫sagl3、sa914基因的编码序列。构建重组质粒pGEM—sagl3、pMDl9-sa914,分别转入感受态细胞Topl0后测序鉴定。经DNAman软件分析测序结果,sagl3全编码序列为732bp与GenBank中核苷酸序列同源率为100%;sagl4全编码序列为738bp与GenBank中核苷酸序列同源率为100%, 并应用SOPMA分析软件对SAGl3、SAGl4的一、二级结构分别进行了预测。(2)原核表达载体pET30-sagl3,pET30-sagl4的构建与表达将克隆的球虫抗原基因sa913、sagl4 分别连入表达载体pET-30a(+)_L构建重组子,将重组子pET30-sa913、pET30- (DE3)中,经Bandscan软件分析SDS—、36kD,其分子量接近理论值(、),利用镍柱层析获得的高纯度蛋白进行 Westernblot鉴定,证实了外源蛋白在宿主菌中得到表达。通过改变培养条件,提高可溶性重组蛋白表达水平,在30"C条件下培养, IPTG诱导2h后收获菌体,%;当30。C条件下培养,lmmol/L IPTG诱导4h后收获菌体,%。在一定程度上有效的提高了可溶性外源蛋白表达量。关键词: 鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原原核表达sagl3 sa914 Abstract The Eimeria species,causative agents idiosis,are seriously harmful tothepoutry have been used tohelp control these diseases for along ,there are issues with increasing development of resistance tomany oftIle anti-idial drugs used tohelp control avian eimeriosis andpublic concerns aboutthe USe ofdrugs ines consist oflive virulent orattenuated Eimeria ines Can have problems with safety,short shelf-life and large-scale production;therefore there interested indevising new ines using defined binant ines and/or DNA binant antigens or DNA hadbeenproved to induce protective immune responses,including some surfaceantigens and secrectory antigens havebeen characterized an