文档介绍：蛋白质含量测定方法汇总
实验七  蛋白质含量测定
 
测定蛋白质的定量方法有很多，目前常用的有染料法，双缩脲(Biuret)法，酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法。
[目的要求]
1．掌握测定蛋白质的含量基本方法。
2．了解染料法、双缩脲法、Lowry法和紫外吸收法测定原理。
 
一、染料法
[实验原理]
在酸性溶液中染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，此时考马斯亮蓝G-250颜色从红色变为蓝色，吸收高峰从460nm移至595nm。利用这个原理可以测定蛋白质含量。
该法近年在某些方面有取代经典的Lowry法趋势，因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。本法的缺点是：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。
[器材]
吸量管； 试管；721型分光光度计
[试剂]
：。
。
：称取考马斯亮蓝G-250 %的酒精50ml，再加入85%的浓磷酸100ml，用水稀释至1000ml,混匀备用。
[操作步骤]
1．  标准曲线的绘制：
试剂(ml)\管号
0
1
2
3
4
5
标准蛋白溶液
0
H2O
0
染料溶液
A595nm
 
 
 
 
 
 
按上表分别向各支试管内加入各种试剂，充分混匀，5min后在595nm波长处以0号管调零,测定各管吸光度值（A）。以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。
2．样品测定：
取1ml样品溶液（约含25～250微克蛋白质），加入染料溶液5ml混匀，5min后测定其595nm吸光度值，对照标准曲线求得蛋白质浓度。
 
二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量
 
[实验原理]
在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰***基(—CO-NH2)，或与此相似的基团[如—CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。测定范围
2．1ml，5ml移液管；
3．坐标纸 ；                           
4．721分光光度计。
[操作步骤]
     取试管7支，编号，按下表操作：
试剂(ml)\管号
空白管
1
2
3
4
5
测定管
蛋白标准液（10g/L）
-
-
生理盐水
-
待测样品
-
-
-
-
-
-
双缩脲试剂
相当蛋白质（g/L）
0
10
20
30
40
50
 
混匀，37℃水浴20分钟，冷却至室温，在分光光度计波长540nm处，用空白管调零，读取各管吸光度值。1～5为标准曲线管，测得吸光度后，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。以测定管的吸光度，在标准曲线上求得蛋白质浓度。
[注意事项]
1．双缩脲试剂中，加入酒石酸钾钠，Cu2+形成稳定的络合铜离子，以防止CuSO4·5H20不稳定形成Cu(OH)2沉淀。酒石酸钾钠与CuSO4·5H20之比不低于3∶1，加入KI作为抗氧化试剂。
2．双缩脲试剂要封闭贮存，防止吸收空气中的二氧化碳。
3．本法各种蛋白质的显色程度基本相同，重复性好，几乎不受温度影响，唯一缺点是灵敏度较低。
4．黄疸血清、严重溶血对本法有明显干扰。
[思考题]   
1．双缩脲法测定蛋白质的原理是什么?其它还有什么方法测定蛋白质的含量?
2．请用双缩脲法，设计一个测定蛋白质含量的定量方法(除标准曲线法外)。
 
三、酚试剂法测定血清蛋白质含量
（改良Lowry法）
[实验原理]
蛋白质分子中所含肽键在碱性条件下与铜络合生成复合物产生紫红色化合物（双缩脲反应）
，同时使肽链展开，蛋白质中半胱氨酸、络氨酸