文档介绍：DNA限制性内切酶消化酶切 DNA restriction enzyme digestion
1
实验原理
核酸限制性内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统， 用于抗击外来DNA的侵袭。
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。
限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键， 产生的DNA片段5’端为P，3’端为OH。
2
限制性内切酶
酶分子
识别位点
切割位点
需用 ATP
Ⅰ类
三亚基双功能酶
二分非对称
至少在识别位点外 1000bp
Yes
Ⅱ类
内切酶与甲基化酶分子不在一起
4-6bp, 大多数为回文对称结构
在识别位点中或靠近识别位点无特异性
No
Ⅲ类
二亚基双功能酶
5-7 bp 非对称
在识别位点下游 24-26bp
Yes
限制性内切酶可分为三类
Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。
Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的特异性切割末端。
Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。
故Ⅰ类和Ⅲ类酶在基因工程中基本不用。
3
Ⅱ类限制性内切酶
Ⅱ型酶就是通常指的DNA限制性内切酶.
Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为4～6个碱基对的反转重复顺序；
Ⅱ型内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口－－5’端突出；3’端突出和平末端。
在对称轴处切割, 产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ: 5‘-CCC↓GGG-3’)；
在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端，如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3‘
3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'
4
酶切反应中应注意的问题
内切酶：
不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶的污染；
注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；
内切酶的用量 根据内切酶单位和DNA用量而定，通常 1U指在适当条件下，1小时内完全酶解１ug特定DNA底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以１ug DNA对２－３u酶短时间为宜。
同时内切酶体积不能超过反应体系10％，因内切酶中含50％甘油，体系中甘油超过5％会抑制内切酶活力；
内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。
5
DNA
作为内切酶底物， DNA应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。
这种抑制可通过：
增加酶作用单位数（10~20U/ug DNA）、增大反应体积以稀释可能的抑制剂或延长反应时间加以克服。
酶切反应中应注意的问题
6
反应缓冲液：
反应缓冲液主要由Tris·HCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+为内切酶辅基；
Tris·-；
NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度：
低盐（10mM NaCl)
中盐（50mM NaCl）
高盐（100mM NaCl）
不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。
酶切反应中应注意的问题
7
酶解温度与时间：
大多数限制酶反应温度为37℃，如EcoRⅠ, HindⅢ, BamHⅠ, PstⅠ等，也有如BclⅠ需在50℃下进行反应，
反应时间根据酶的单位与ＤＮＡ用量之比来定，原则是酶：ＤＮＡ=2－3：1
2小时即可，充分酶解。
酶切反应中应注意的问题
8
二、实验试剂
限制性内切酶(EcoR I)
DNA（质粒DNA,插入片断1200bp）
10×H buffer:
500mM Tris HCl
100mM MgCl2
1000mM NaCl
10mM Dithiothreitol 二硫苏糖醇; DTT
无菌水
9
三．实验方法
按下表分别加入各试剂（注意限制性内切酶最后加入且在冰上操作）于Eppendorf管中。
DNA uL
10×H buffer uL
无菌水
内切酶 uL
总体积： uL
10