文档介绍：中山大学
博士后学位论文
按人造血发育程序诱导胚胎干细胞为造血干细胞的实验研究
姓名:张绪超
申请学位级别:博士后
专业:临床医学·儿科学
指导教师:黄绍良
20051101
英文缩写词表璓瓾狵癈甋猄·—.
按人造血发育程序诱导胚胎干细胞为造血干细胞的实验研究合作导师:黄绍良教授中山大学第二附属医院干细胞研究中心、儿科,广州中文摘要博十后:张绪超胚胎干细胞,是具有自我更新和向机体三个胚层各种细胞分化潜能的原始细胞。自动物胚胎干细胞建系以来,定向造血分化就成为研究的热点。年人类胚胎干细胞建系以后,在定向造血研究领域更加活跃。,主物技术角度看,在将来有望可采用治疗性克隆技术实现〈捕裥匝R翰白血病、淋巴瘤等⒁糯ú地中海贫血驮偕习云堆5妊R合低臣膊〉南赴娲瘟啤H缒苁迪痔逋夤婺;罅可血千/祖细胞,则可最终解决临床移植中供体来源不足的难题。胚胎干细胞是机体发育最原始的细胞,体外适当条件捎盏挤⒂;宥嘀掷嘈拖胞,为认识特定组织细胞的发生、分化发育、生长调控等基本生命现象机制提供了最适细胞模型。在造血分化方己证实小鼠和人细胞在体外多种培养体系和细胞因子的联合作用下可扩增出髓系、红系、淋巴系等各类造赴D壳癊赴谔逋舛ㄏ蚍只T煅干细胞,的模型多为胎肝、卵黄囊、骨髓基质细胞或条件培养液组成的二阶段、三阶段培养体系模型。各共培养系统中的饲养层细胞虽然多为动物造血位点来源的细胞,但往往诱导产生的造血于/祖细胞效率高。随着胚胎造血发生和发育研究的进展,科学界逐渐共识脊椎动物的确定造血发生多起源于胚内猄疉区,稍后迁移至肝脏,进而定居骨髓直至维持终生造血功能。据此造血发生和迁移理论,本研究首次拟按照人胚胎确定造血发生发育的时空演化过程,分别以人胚造血活动期的氏赴⑻ジ卧煅F诨氏赴⒐撬杌氏赴凑赵煅7⒂笨账序作为饲养层共培养细胞,分阶段将小鼠细胞定向诱导分化为造血干细胞,观察其造血干细胞诱导特性和成体动物重建造血的能力,为造血发生发育的时空演化分子机制研究建立模型,也为最终实现人细胞的应用进行技术上的探索和准备。
本研究主要内容分为以下几个部分:、促进小鼠咛ジ上赴⒂8缓煅G疤逑赴哪庵猓禾煌煅N坏慊氏赴才嘌逑荡俳馀咛逶葱韵赴徊椒只T煅8上赴人胚发育早期氏赴俳馀咛逑赴煅7只⒂人:孕中期胎肝基质细胞促进上述盏己笙赴合蛟煅7只⒂人骨髓基质细胞进一步促进赴徊较蛟煅7只髯槎ㄏ蛴盏继跫禄竦迷煅8上赴闹铝鲂约觳夂统商宥镌煅V亟ㄊ笛第一部分、对蚰馀咛宸⒂讨性煅G疤逑赴挠盏甲饔芯糠椒将小鼠咛ジ上赴稚び诘撞闫逃行∈笈咛コ上宋赴,饲养层的紫赴嘌逯校~齑ù嘌杀3至己玫奈捶只状态。在诱导⒂狤跋冉獷逐步驯化培养至能够脱离饲养层细胞生长,即将细胞接种至底层预先铺有%明胶的培养板中,撤去饲养层,在含痬∈驦的培养液中培养。将能够在脱离饲养层细胞条件下形成克隆的胚胎干细胞进一步传代培养。将×痬赴又种妇嘌螅嘌:%胎牛血清、一巯基乙醇、疞劝滨0返募谆宋匕牍烫迮嘌T诓舛ú煌浓度盏糆⒂讨性煅G疤逑赴⑸в∩希菖嘌逑抵杏形尢砑因子分为两组:。组为未添加任何冈子的自然分化组,另一组含/。置于。%ズ褪6扰嘌渲信嘌~彀肓炕灰骸看危湮⒕迪观察形成情况,分别于培养、,吹打形成单细胞悬液,进行流式细胞仪检测——细胞含量,并进行造血细胞集落培养。芯拷峁赴诎籽2∫种埔蜃存在条件下可脱离赴ち己茫晌治分化状态。接种至小鼠体内可形成畸胎瘤,具有向三个胚层分化的能力渭部分痬,、甀/,
将脱离饲养层细胞代的赴诩谆宋匕牍烫迮嘌杏盏挤只嘌天后细胞逐渐形成小的,至焓盓J荚龆唷⒈浯螅翁衔9嬖颍迪驴见的结构为一群致密的细胞团,第焓盓纬纱锏礁叻澹焓盓翁较完整。分别于培养、焓笔栈馝傻ハ赴汉螅魇较赴羌觳一琄赴壤=峁砻鳎刺砑尤魏我蜃拥淖苑⒎,焓贝锏椒逯担.±,为.±ィ胱苑⒎只橄啾扔邢著性差异。提示在诱导拟胚体阶段添加、等凶子可明显促进中胚层造血前体细胞的形成优势。.细胞含量在添加因子纽第天表达为ィ隙哉兆繭.%邢灾龈咔魇。取赴俜直却锏椒逯档氖奔涠问栈馝傻ハ赴汉蠼性煅O赴集落培养,结果显示斓腅赴尚纬珊煜怠⒘O导洌拷仙伲矣薪隙二级拟胚体形成基硎;卜脑煅Q洹1狙芯刻崾綛蚔蜃恿:鲜褂每纱俳中胚层造血前体细胞的形成。第二部分按胚胎发育时空顺序诱导细胞向造血干细胞发育分化丫谔逋饪杀欢ㄏ蛴盏嘉6嘀掷嘈拖赴延性煅6ㄏ蚍只难芯孔柿暇不诱导效率不高,且分化时相控制较难,往往易得到分化终末期的细胞,如成熟的红系、粒系及淋巴细胞等,较难得到处于分化早期、能够重建造血的R虼耍绾慰制分化的时相,诱导、扩增出大量处于分化早期的悄壳癊造血分化研究的重点。根据造血发生发育生物学知识,早期各造血位点的微环境对原始造血前体细胞向造方向分化具有重要的调节作用。这些造血微