文档介绍：实验二蛋白质颜色反应及蛋白质含量测定
实验二蛋白质颜色反应及蛋白质含量测定
一、实验目的
、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。
、学****几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。
、学****考马斯亮蓝法、双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和方法
实验二蛋白质颜色反应及蛋白质含量测定
二、实验重点难点
、双缩脲反应及茚三***反应的实验原理
、对于双缩脲反应中碱和硫酸铜的添加顺序
、茚三***反应中颜色变化过程
、测定蛋白质含量的实验原理、标准曲线制定
实验二蛋白质颜色反应及蛋白质含量测定
三、实验原理
、概括
蛋白质(Protein)是由许多不同的氨基酸，按照一定的顺序，通过肽键连接而成的一条或多条肽链构成的生物大分子。
氨基酸的基本结构为：
蛋白质的主要连接方式为：
不变部分
可变部分
实验二蛋白质颜色反应及蛋白质含量测定
蛋白质与氨基酸的颜色反应总结
反应名称
反应基团
反应操作
反应产物及现象
用途
双缩脲反应
肽键
NaOH及CuSO4 1ml样+2ml0%NaOH+2d CuSO4
Cu –Cu—双缩脲络合物（兰紫色）
测蛋白质含量鉴定蛋白质水解是否完全
茚三***反应
α-氨基酸
***试剂+1ml样
兰紫色
测AA含量检验AA及蛋白质
黄色反应
苯环、Try、Tyr
1ml样+3~4d浓HNO3 观察再加NaOH，再观察
黄色硝醌酸生成
鉴定Try、Tyr
坂口反应
胍基
样1ml+5d15%NaOH+2d1% α-萘酚+6d次溴酸钠
玫瑰红色产物生成
鉴定Arg 测定Arg含量
乙醛酸反应
吲哚环
样1ml+2ml冰乙酸+浓HSO4 (沿壁且不能混匀)微热
中间生成兰紫色环
鉴定Try
偶氮反应
咪唑基
样1ml+偶氮试剂与20%NaOH1ml
有橙色和鲜红色产物生成
鉴定His、Tyr
醋酸铅反应
巯基、CyS CySH
%Pb(AC)2+10%NaOH+1ml样+加热后再加HCl闻其味
黑色PbS生成臭鸡蛋味
鉴定含硫AA CyS、CySH
实验二蛋白质颜色反应及蛋白质含量测定
、双缩脲反应
双缩脲能够与碱性硫酸铜作用，产生兰色的铜-双缩脲络合物，称为双缩脲反应。在一定浓度范围内，反应后颜色深浅与蛋白质含量呈线性关系。蛋白质浓度越高，体系的颜色越深。反应产物在540nm处有最大光吸收。
含有两个以上肽键的多肽，具有与双缩脲相似的结构特点，也能发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色络合物。
这是多肽定量测定的重要反应。但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。含有一个肽键和一个—CS—NH2，—CH2—NH2，—CRH—NH2，—CH2—NH2—CHNH2—CH2OH或—CHOHCH2NH2等基团的物质也有此反应。NH3干扰此反应，因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色的络离子Cu（NH3）42+。
实验二蛋白质颜色反应及蛋白质含量测定
双缩脲法测蛋白质浓度操作简便、迅速，蛋白质浓度与光密度的线性关系好，是蛋白质浓度分析的常用方法之一，但本法缺点是灵敏度低，蛋白质量须在1-20mg/mL测定结果较准确。在需要快速、但准确性要求不高的测定中常用此法。
实验二蛋白质颜色反应及蛋白质含量测定
、茚三***反应
C
2
C
H
C
C
C
O
O
H
O
H
2
C
C
O
O
H
R
C
C
C
O
O
O
H
O
H
还原茚三***
茚三***
水合茚三***
O
NH3
R
O
+
+
+
+
H
N
H
水合茚三***
茚三***
还原茚三***
篮紫色化合物
茚三***反应，即：所有氨基酸及具有游离α-氨基的肽与茚三***反应都产生蓝紫色物质，只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三***反应产生黄色物质。在570nm波长下进行比色就可测定样品中氨基酸的含量，也可以在分离氨基酸时作为显色剂对氨基酸进行定性或定量分析。-丙氨酸、氨、许多一级***呈正反应。
在法医学上，使用茚三***反应可采集嫌疑犯在犯罪现场留下来的指纹。因为手汗中含有多种氨基酸，遇茚三***后起显色反应。
实验二蛋白质颜色反应及蛋白质含量测定
、米伦氏反应（Millon反应）
苯酚及某些二羟苯衍生物中加入米伦试剂(***、亚***、******、亚******的混合物)后产生白色沉淀，可能是羟苯之亚硝基衍生物，经变位作用变成颜色更深的邻醌肟，最终得具有稳定红色的产物。含有酚基的化合物都有这个反应，故酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白质