文档介绍：上海交通大学
博士学位论文
大肠杆菌条件性基因表达调控系统的构建与应用
姓名:梁如冰
申请学位级别:博士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:刘建华
20070301
大肠杆菌条件性基因表达调控系统的构建与应用摘要随着许多生物基因组测序的完成,,产生目的蛋白;而在非允许温度,的重点。其中,必需基因由于其序列的保守性,对细胞功能的核心作用及其作为药物作用靶点的潜能而吸引了研究者更多的注意。由于传统的基因敲除方法对必需基因的操作会引发细胞致死效应,难于直接对其分析,亟需开发新的基因功能研究系统。据此,我们构建了两套大肠杆菌跫曰虮泶锏骺叵低常疚闹饕=樯了这两套系统各自的原理及其应用。常用系统;与其他系统相比,突变体具有反应速度快、应用范围广和可逆性高等优势。在此,我们将温度敏感的蛋白质内含肽与大肠杆菌蛋白表达系统相结合,构建了一套温度敏感的表达系统,从而制造目的基因温敏表型的大肠杆菌。将一个温度敏感的酿酒酵母牡鞍啄诤肽基因插入酆厦副嗦牖虻腁虲Α8脑旌的酆厦附鲈谠市砦露℃啪哂谢钚裕拍芷鹗糡由于胞内不存在目的蛋白,细胞表现为基因敲除表型。
酆厦覆⒀橹ち似湮露让舾行浴外源蛋白,其水平与带有野生型酆厦不含内含肽木株中该蛋白的表达水平基本一致。为了研究温敏的行了细胞表型实验。结果表明,含温敏温度下呈现野生菌株表型,而在胁迫温度下则呈现基因敲除表型。这说明把目的基因插入启动子下游,温敏,表达系统会使细胞呈现则不能;而大肠杆菌酆厦冈谌魏挝露认露疾荒芷舳疶舳乳糖苷酶基因和四环素基因橹ち烁孟低车挠行浴J先,我们构建了温度敏感的体外酆厦富钚允笛楸砻骱吧湍诤牡腡酆厦在任何温度下都具有活性,而不能剪切的内含肽的插入则可以完全抑制酆厦傅幕钚浴U馑得鰽虲δ诤牡牟迦是有效的,内含肽的剪切与否直接调控酆厦傅幕钚浴M庠蛋白表达效率实验表明含温敏内含肽的酆厦傅幕钚灾苯邮温度的控制;允许温度下,含温敏酆厦傅木昕筛咝П泶酆厦付目的基因表达的调控是否可使细胞呈现该基因的温敏表型,我们又进酆厦傅木暝谠市温敏突变体表型。进一步我们分析了温敏表达系统的调控机制。定量峁砻鳎谢钚訲酆厦复嬖时目的基因的转录量是无酆厦复嬖℃钡蹲笥摇M保单个菌细胞的目的转录子个数检测结果表明无酆厦甘℃诩负醪荒芗觳獾阶B甲拥拇嬖凇U馑得魑旅鬞在允许温度下可以高效启动启动子下游基因的转录,在胁迫温度下
下游基因的转录。也就是说,在此温敏表达系统中,因大肠杆菌和酶活性实验酆厦复嬖谑℃旅鬞泶锵低持酆厦傅拇许温度转入胁迫温度约∈焙螅谝鸭负醪荒芗觳獾侥康牡鞍椎温敏表达系统的菌细胞中目的基因的表达可以被迅速而有效地终止。总之,上述所有结果充分证实该温敏表达系统是受温度严格控此系统可使细胞呈现类似目的基因温敏突变体的表型。该温敏表达系统诱导与终止目的基因表达的速度快,可逆性强,操作简单,背景变体构建的缺陷;同时,它不需将直接插入目的基因,避免了位点选择和插入失活等问题,大大减少了工作量。此外,因其较高的低温表达效率,该系统还可以用于低温下外源蛋白表达,特别是一些高酆厦甘侗鹌舳佣谋尘凹ǖ汀则表明,当没有几乎不能检测到目的蛋白;而℃时,因有活性在,可检测到大量有活性的目的蛋白。这说明,目的蛋白的表达直接与酆厦傅幕钚韵喙兀春旅鬞泶锵低车木暝谠市砦度下可以正常地表达目的蛋白,而胁迫温度下则不能。同时,胁迫温度下目的基因的表达终止实验表明含温敏表达系统的菌株在从允存在。这说明温敏表达系统对温度十分敏感;转入胁迫温度后,含制的,它可以有效地启动和终止目的基因的转录与表达。因此,利用表达极低;该系统未在目的基因序列中引入突变,可避免传统温敏突温下不稳定或会发生错误折叠的蛋白的表达。它也实现了合酶和表达盒在染色体上的共整合,为基因工程和发酵生产等提供
实现温度控制基因表达的报道。必需基因的缺失突变体,传统基因筛选方法无法应用于新必需基因的筛选;而其他条件性基因表达系统很难达到真正的缺失突变体效果,因敲除互补系统,实现了基因敲除与功能互补的同步完成,达到未知必需基因筛选的目的。首先将两个汀侧;之后,将一个含有阿拉伯糖控制的刈槊富蚝妥槌尚员泶锏目的基因的质粒转化到该修饰菌中。阿拉伯糖存在时,刈槊富崆除两个坏阒涞男蛄包括必需基因和标记基因4耸保条件性基因控制的不严紧性;而且,该系统中基因敲除和功能互补的同步完成既避免了敲除致死效应,又大大降低了工作量。首先,⒗了新思路。这是首例在大肠杆菌中通过温敏内含肽调控聚合酶活性来生物基因组测序的完成为新基因的筛选提供了可能。由于不能获得也不能应用。为了解决这一问题,我们将阿拉伯糖操纵子系统与位点特异性刈槊系统相结合,构建了一套