文档介绍：基因工程 Genetic Engineering
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２００9
基因工程课程内容
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基因工程概论
分子克隆单元操作
大肠杆菌基因工程
非肠道细菌基因工程
真菌基因工程
昆虫基因工程
高等动物基因工程
高等植物基因工程
蛋白质工程、途径工程
第二章 分子克隆单元操作
克隆载体
DNA的体外重组（切与接）
目的基因的克隆
基因操作常用技术
转化与扩增（转与增）
转化子的筛选与重组子的鉴定（检）
DNA的体外重组（切、接）
三、其他用于DNA重组的工具酶
二、T4DNA链接酶
一、限制性核酸内切酶
四、DNA体外重组操作
四、DNA体外重组操作
提高重组率的策略
DNA的连接策略
DNA的酶切操作策略
DNA酶切片段的纯化
1、DNA酶切组合策略与操作
尽量采用双酶切片段重组
（基因插入方向确定）
尽量不要采用多克隆位点中紧邻的酶
不能采用外源基因内部有切点的酶
尽量采用同盐浓度要求的酶组合
尽量采用常用酶组合
尽量通过PCR引物设计优
化酶切组合
1）限切酶的盐浓度要求与操作
低盐酶：0 - 50 mM
中盐酶：100 mM
高盐酶：150 mM
限切酶活性对盐浓度高度敏感，据盐浓度要求分三类：
多酶联合酶解时的策略
A、对盐浓度要求相同的酶可以同时酶切
5‘ …GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’
3‘ …CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’
BamHI SmaI
5‘ …GCTACATG GATCCCGGGTTCGCAT…3’
3‘ …CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA…5’
5‘ …GCTACATGGATCCC GGGTTCGCAT…3’
3‘ …CGATGTACCTAGGG CCCAAGCGTA…5’
但应注意：紧密相连时难切割
B、对盐浓度要求不同的酶，可采取下列策略：
使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解
低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切
一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切
5 M NaAc pH
冰浴 5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥
2）DNA样品纯度要求与操作
待酶切DNA样品必须达到较高纯度，样品中的蛋白质、苯酚、***仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等杂质过多抑制酶活性。
策略：
加大酶的用量
加大反应总体积
延长反应时间