文档介绍：基因工程实验流程总览
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DNA提取，纯化
限制图谱
琼脂糖电泳检测片段
体外扩增PCR
目的基因制备
载体选择
DNA重组片段连接
未知核酸序列须
DN***段大小估计
互补性黏性
不互补性黏性末端
平末端
限制性核酸内切酶酶切分离法简单基因组分离如质粒和病毒
物理化学法
构建基因组文库
PCR扩增
基因的化学合成
双抗体免疫法
酶促反应mRNA-cDNA
目的基因分离
双酶切
部分酶切
Bal31逐步切割
转座子
基因定位克隆
酵母双杂交
前处理防止自连
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RNA提取
RT-PCR
TA克隆
蓝白选择
胶回收
表达引物PCR
载体
PCR产物回收
转化感受态细胞
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构建基因组文库
真核生物有成千上万个碱基对，单个未知基因在整个基因组中的比例很小且不能在体外特异性扩增，所以只能对所有基因扩增，也就是构建基因组文库。
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油菜TOC33基因片的克隆
实验项目背景
国家自然科学基金项目（油菜叶绿体蛋白质转运突变体中差异表达基因的克隆，编号：）。
实验目的
通过本综合实验，掌握植物基因组DNA的制备技术、PCR技术、限制性内切酶酶切技术、重组DNA技术、克隆鉴定技术、质粒DNA的制备、琼脂糖凝胶电泳技术、测序技术、生物信息技术等，得到一个与科学研究过程相近的分子生物学综合技能训练。
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具体实验步骤
Ⅰ.植物基因组DNA的制备
Ⅱ.TOC33基因片段的PCR扩增
Ⅲ. DNA的琼脂糖凝胶上回收与纯化
IV. DN***段的体外重组与转化
V. 克隆的筛选与鉴定
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Ⅰ.植物基因组DNA的制备
EP管中，放在液氮中冷冻处理后，在EP管中充分捣碎， 抽提缓冲液，65℃水浴处理10min。
12,000rpm离心3min，取上清，加入二倍体积预冷的无水乙醇沉淀，遇有絮状沉淀，4,000rpm离心5min。
沉淀用50ul TE-RNase（ pH ， EDTA pH ，RNase A 30ug/mL）溶解，37℃保温处理15min。
加入二倍体积预冷的无水乙醇，-20℃下沉淀10min ，4,000rpm离心3min，加适量70%乙醇洗沉淀，自然干燥或37℃烘干，加入50ul ddH2O溶解备用。
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Ⅱ.TOC33基因片段的PCR扩增
引物设计，为扩增Toc33片段，用OLIG05. 0设计1对PCR引物:
上游引物P1: 5'一ATGGGGTCTCTCGTTCGTGAAT-3'，
下游引物P2：5'一TTAAAGTGGCTTTCCACTTGTC一3'。
：
10×PCR Buffer ul
Mg2+ ul
dNTP ul
Primer 1 ul
Primer 2 ul
Taq 酶 ul
模板 ul
ddH2O ul
1)       94 oC 预变性 5 min
2)       94 oC变性 30 sec
3)       55 oC退火 30 sec
4)       72 oC延伸 45 sec
5)       重复步骤2)-4)30次
6)       72 oC延伸10 min
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琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果
1) ，再加入1ml 50×TAE缓冲液，49ml 高水，置微波炉或水浴加热至完全融化，取出摇匀，则为1％琼脂糖凝胶液。
2)   取电泳槽里面的胶板，用胶带将两端封好，调平，并放好样品梳子。
3) 将冷到60oC左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入胶板，直至胶板上形成一层均匀的胶面。
4) 待胶凝固后，取出梳子，放在电泳槽内。电泳槽内应加入电泳缓冲液。
5)  用移液枪将已加入上样缓冲液的PCR产物加入加样孔。
6) 接通电泳槽和电泳仪的电源（注意正负极，DN***段从负极向正极移动）；选择合适的电压，开始电泳；
7)  当溴酚蓝燃料移动倒距离凝胶前言1－2cm处，停止电泳。
8) 将电泳的凝胶浸入溴化乙锭染色液中，染色10min后取出，用清水冲洗。将胶放于凝胶成像系统内拍照，以观察样品在琼脂糖凝胶中的带（EB有剧毒，戴手套操作）。
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电泳染色后，在紫外分析仪上切取所需要的条