文档介绍：标题：包含弗林蛋白酶裂解序列的重组蛋白e23sFv-TD-tBID对
HER-2阳性肿瘤细胞的选择性毒性的研究
背景：1. HER2,即人类表皮生长因子受体-2
HER2是一种膜表面结合酪氨酸激酶活性型受体。其涉及转导通路。该通路导致了细胞生长和分化。
它由原癌基因HER2/neu编码.
HER-2存在于乳腺癌上的抗原，是免疫疗法的靶点。
EGF家族配体无法激活HER-2
然而HER-2和ErbB受体家族的其他成员由单体转化为二聚体聚合可以激活其活性。（EGFR属于ErbB受体家族的一种）
简介：1. HER2/neu原癌基因编码了一个分子量在185kDa的跨膜糖蛋白，其属于生长因子受体家族，并且它本身带有酪氨酸激酶活性。
在25%到30%的原发性人类乳腺癌中都有HER2/neu的高表达，其也与预后差有关。
3•因为它在喜欢在肿瘤细胞表达，所以它是理想的以抗体为
导向的靶点。
免疫***依靠其毒性的效能，通过特异性的配体锁定癌细胞达到杀死肿瘤细胞的作用。
目前另一种重组免疫***已成功地用于临床试验。
e23sFv-TD-tBID 介绍
基于先前构建的免疫***e23sFv-PEA40,我们开发出一组重组免疫促凋亡分子。其包括了抗-HER2单链可变区抗体片段 (scFv) o
BID属于促凋亡Bel - 2蛋白家族，主要在线粒体水平参与了细胞凋亡的调控
Bid蛋白水解形成其截短形式tBIDo tEID是促凋亡活性的一个先决条件。tEID可以促进凋亡因子的释放。
一个大小在10个残基的弗林蛋白酶裂解序列融合在抗体片段和tEID之间。
图片：A代表：重组免疫促凋亡分子e23sFv-TD-tBIDo N末端有 HIS标签。
B :表达重组蛋白的细菌SDS-PAGE分析。
C:纯化后蛋白SDS-PAGE分析
D： Western blot 分析。
重组蛋白的活性鉴定：
细胞 ELISE :
HER2阳性SKBR3细胞和HER2受体阴性的人脐静脉内皮细胞（内皮细胞）接种于96 孔板。
用含有6%牛血清白蛋白的PBS封闭后, 加入纯化后的1 P g/mL e23sFv-TDtBID孵育 90mino再用抗HIS单抗和辣根过氧化物酶抗鼠IgG孵育2次，每次lh。在使用3, 3, , 5, 5'- 四***联苯***后，在450nm处测其吸收峰。
通过检测线粒体膜电位损失评估促凋亡效果
体内抗肿瘤活性：在雌性EALE / c裸鼠
（4-6周龄）右侧乳腺细胞接种5 X IO'人乳腺癌SK-BR-3脂肪。用不同的治疗因子处理细胞：e23sFv-TD-tBID （5mg/KG,在 0,2,4, 6,8天时处理），赫赛汀（10mg/kg, 处理时间同上），紫杉类药物紫杉醇（15 毫克/公斤，1-3天时处理），阿霉素（5 mg/kg, 1天），PBS作对照。每周测定小鼠体重和肿瘤的大小两到三次。
结果：图2： A表示，细胞酶联免疫吸附实验中e23sFv-TD-tBID对 HER2阴性细胞HUVEC和HER2阳性细胞SK-BR-3的实验结果。
B表示，各种HER2阳性的细胞，一种HER2阴性的细
胞和重组抗体e23sFv-TD-tBID的特异性结合能力。
C表示，当加入抗HER2单抗时，重组蛋白的特异结合能力，这个实验旨在说明附加物tEID并没有改变e23sFv的结合特异性。
D表示，通过共聚焦显微镜观察到的SK-BR-3细胞中内化的重组免疫***(e23sFv-TD-tBID)o小图a表示，在4摄氏度下孵育的情况，小图b表示，在37摄氏度下孵育的情况。
结果显示重组蛋白可以完全结合到所有5种HER2阳性细胞。当加入HER2单抗后，这种互动可以被完全阻断，表面tEID并没有改变e23sFv的结合特异性。
图3： A,流式细胞仪分析HER2的表达水平。
共聚焦显微镜分析e23sFv-TD-tBID对人类乳腺癌肿瘤细胞结合实验结果。对照组用了同样带有HIS标签的蛋白作为对照。这个实验表明，his标签没有影响重组抗体的特异性。
图4： A, 5种肿瘤细胞用重组蛋白处理48小时的剂量反应曲线 (可以先不说这组实验说明各种肿瘤细胞HER2表面表
达量和其对重组抗体敏感性的关联性。)
诱导细胞凋亡评估
e23sFv-TD-tBID介导的细胞凋亡的特点是线粒体跨膜电位减少
Baf：内涵体抑制物baf dec-RVKR-cmk：弗林蛋白酶抑制物 BFA：蛋白质运输抑制剂bfa最后文章总结说：内化的重组蛋白在被弗林蛋白酶裂解后直接转运至细胞质。
图5： A,三组小鼠在用重组蛋白处理后其肿瘤生长有明显的抑制，在5或10 mg/k