文档介绍：室猪精液品质检测新技术
精子畸形率检测
取中层精液抹片
固定液固定20min
Giemsa染色90min
水洗并风干
置1000倍油镜下
观察精子＞ 300个
畸形率检查方法
相差显微镜直接观察
伊红或姬姆萨等染色后普通显微镜观察
畸形率要求
染色后显微镜观查
影响：畸形率过高会减少精液的受精能力
要求：一般要求不超过18%为宜
改善：增加精液的用量可以提高其受精效果
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精子质膜完整性检测
精子质膜染料分类
精子不同区域质膜的检测
目前主要的精子质膜检测方法
精子质膜作用及分布
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精子质膜作用及分布
维持完整的
细胞内环境
受精过程中起到信
号识别与传导作用
转运物质功能
覆盖于顶体外
膜区上的质膜
覆盖于精子头部
非顶体区的质膜
覆盖于尾部的中段
和主段部分的质膜
作用
分布
精子
质膜
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染色原理：此种染料不能进入质膜完整功能的精子内部，只能进入质膜受损的精子，并与DNA结合发出荧光。
染色原理：活精子特异的荧光染料是膜通透性的染料，只能进入细胞膜完整的精子。
Hoechst33342
SYBR-14
羧基荧光素双醋酸盐 (CFDA)
羧基二***荧光素双醋酸盐(CMFDA)
Carboxy-SNARF-1
SYTO-17
荧光染料
死精子特异性荧光染料
活精子特异性荧光染料
非荧光染料
伊红—苯***黑染色
伊红—苯***蓝染色
苔盼兰—吉姆萨染色
碘化丙锭（PI）
Hoechst33258
溴化乙锭（EB）
溴乙啡锭二聚体（EthD-1）
Yo-Pro-1
质膜染料分类
精子质膜染料分类
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精子不同区域质膜的检测
覆盖于顶体外
膜区上的质膜
覆盖于精子头部
非顶体区的质膜
覆盖于尾部的中段
和主段部分的质膜
荧光染料，例如碘化丙锭（PI）、溴化乙锭（EB）、DAPI、 Hoechst 33258等
非荧光染料，例如伊红—苯***黑染色、伊红—苯***蓝染色等
精子的低渗肿胀实验（HOST）检测
通常与顶体外膜完整性的检测联合起来进行
原理：低渗溶液中，有生物活性的精子质膜会使水分子进入质膜中，直到精子内外环境达到平衡为止。水的内流使精子尾部的质膜膨胀并且尾部会发生弯曲。但是精子质膜损伤或失去生物活性，水能够自由通过质膜，在胞质内不会积聚液体从而不会出现肿胀和尾部弯曲。通过相差显微镜可以观测到精子质膜对低渗液的反应。
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精子质膜检测方法
利用显微镜进行检测
Ａ
Ｂ
Ｃ
Ａ：被PI染色的死精子，为红色；
Ｂ：被SYBR-14染色活精子，为绿色，膜功能完整；
Ｃ：被SYBR-14／PI染色，绿色为膜完整的活精子，
红色为死精子。
红箭头所指区域为被PI
染色的死精子；
蓝箭头所指区域为被
SYBR-14染色活精子；
利用流式细胞仪检测
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线粒体功能检测
精子线粒体检测方法
检测线粒体的染料分类
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检测线粒体的染料分类
染料名称
染色特性
优缺点
R123
（Rhodamine123）
MITO
（MitoTracker Green FM）
JC-1
（5,5',6,6'-tetrachloro-1,1 ',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl-carbocyanine iodide）
能渗透并沉积在正常线粒体上发出绿色荧光。如果线粒体损坏则不发绿色荧光。
MITO 在水溶液中不发荧光，而当积聚在线粒体内时会发绿色荧光。
线粒体膜电位低时，发绿色荧光；膜电位高时发橙色荧光
在精子头部和尾部有非特异性染色，可检测线粒体有无功能，不能区别膜电位高低。
MITO在精子头部有非特异性染色。
J C-1 染色的特异性最好，仅在线粒体部位发黄色或绿色荧光。
精子运动能力与线粒体的活性密切相关，整个精子代谢所需的能量主要由线粒体提供
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精子线粒体检测方法
检测方法：
荧光显微镜
流式细胞仪
最适合的荧光染料：J C-1
荧光显微镜检测：
a： R123染色，在精子头部和尾部有非特异性染色，可检测线粒体有无功能，不能区别膜电位高低。
b： J C-1 染色，其特异性最好，仅在线粒体部位发黄色或绿色荧光。
c： MITO染色，在精子头部有非特异性染色。
流式细胞仪检测：
A：R123/PI染色，箭头指发绿色荧光精子；
B：