1 / 9
文档名称:

寡核苷酸的纯化与质量鉴定.doc

格式:doc   大小:35KB   页数:9页
下载后只包含 1 个 DOC 格式的文档,没有任何的图纸或源代码,查看文件列表

如果您已付费下载过本站文档,您可以点这里二次下载

分享

预览

寡核苷酸的纯化与质量鉴定.doc

上传人:guoxiachuanyue010 2021/8/5 文件大小:35 KB

下载得到文件列表

寡核苷酸的纯化与质量鉴定.doc

文档介绍

文档介绍:: .
最新资料推荐
寡核昔酸的纯化与质量鉴定
寡核昔酸的纯化与质量鉴定 市售或者委托别人合成的寡
核昔酸常常已经纯化,自行合成的须经过纯化后方可应用。
一'寡核昔酸的收获和去保护基 结合在合成柱内玻璃
粉上的寡核昔酸链经浓氨水处理后便脱落下来,核昔酸链上的保护基因在浓氨 水中于55C水浴中保温6小时以上被去除 经Sephadex-G25柱脱盐干燥后 分装保存。
(一)将合成柱一头的圭寸盖打开,将颗粒倒入一个
有密封垫的螺口盖小瓶内,加入新开封的浓氨水 2ml0
密圭寸好,置55C水浴过夜(至少6小时)。
这步操作将脱支持物与去保护基两步合并到一起,目的是为了减少脱 支持物不彻底造成的寡核昔酸的丢失。
合成柱不易拆开的,可在合成柱一端接上5ml—次性注射器,分两
次加入以上量的浓氨水,使氨水充满合成柱并设法使之停留在柱内,留置15分 钟后将氨水推入小瓶内,再向柱内注入第二次氨水,作用15分钟后推出。
同法进行55 C过夜处理。
用注射器注入氨水需注意尽量密封,以免氨气挥发,可将注射器的活塞插
入针管内,推入的距离不要太大,以免压力过大使氨水从柱 的另一端流出。
(-)从55C水浴中取出小瓶后不能立即开盖以免液体因氨
气的逸出而飞溅,需将小瓶置4C冷却,以降低瓶内氨气产生的压力。
(三)准备 Sephadex-G25 柱。
称取10gSephadexG25,®在200ml去离子水中,待浸透后置
100C水浴中煮沸1小时。
室温下放置30分钟,倾去上层不沉淀小颗粒。
用一个10ml—次性注射器制作分离柱,柱下不接导管,装Sephadex-
G25至10ml刻度,在顶上放一圆形滤纸片,以防止加液 时搅动柱床,用 30ml1%氨水洗柱,让液体自然流干。

准确的体积可用蓝葡聚糖溶液测定。
( 四)将过夜处理的寡核昔酸浓氨水液加到Sephadex柱上
%氨气洗涤小瓶,待液体完全进柱后将其加入柱,%氨 。
若重复使用Sephadex柱,起码要用30ml1%氨水洗脱,除去柱内 的盐份。
(五)测 OD26Q
取4I收集液用去离子水1 ml稀释后于260nm测OD值。
( 六)收集液适当分装成数份(如每份5OD),于-20C冻结, 在离心真空浓缩器中干燥。
( 七)离心真空干燥,然后用去离子水()溶解干粉,再
真空干燥一次,将寡核昔酸溶解适当浓度备用。
根据1OD=40g寡核昔酸计算产量。
为了不浪费寡核昔酸,测0D所用的稀释液可以保留,可用来溶 解寡核昔 酸' 进行5末端标记等。
注意每次测定寡核昔酸浓度时应将比色杯清洗干净,以免被其他
DNA污染。
干燥的寡核昔酸可在室温下运输,收藏最好于低温。
二、寡核昔酸质量鉴定 寡核昔酸的质量需经电泳鉴
定,确定产物的纯度。
取大约20ng寡核昔酸进行5末端标记,(操作见寡核昔酸探针标记部
分)。
用20%聚丙烯酰***变性胶电泳分离,用已知长度的标记寡核昔酸作长度对 照,放