文档介绍：蛋白质测定方法比较简介蛋白质( protein )是生命的物质基础,没有蛋白质就没有生命。因此,它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。食物蛋白质的质和量、各种氨基酸的比例,关系到人体蛋白质合成的量,尤其是青少年的生长发育、孕产妇的优生优育、老年人的健康长寿,都与膳食中蛋白质的量有着密切的关系。人体的生长、发育、运动、遗传、繁殖等一切生命活动都离不开蛋白质。生命运动需要蛋白质,也离不开蛋白质。蛋白质含量测定主要有五种方法,分别是凯式定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、酚试剂法和考马斯亮蓝法。这五种方法各有特点,优缺点明确。下面是我依照原理,优缺点,应用范围所对五种方法作的一些简单介绍。原理凯氏定氮法蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化,使蛋白质分解,产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵,留在消化液中,然后加碱蒸馏使氨游离, 用硼酸吸收后,再用盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数, 即得蛋白质含量。因为食品中除蛋白质外,还含有其它含氮物质,所以此蛋白质称为粗蛋白。双缩脲定氮法双缩脲(NH 3CONHCONH 3)是两个分子脲经 180 ℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与 CuSO 4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰***基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。 H =O HNNH R-CH CH-R O=C CuC=O HNNH R-CH CH-R H 2O紫色络合物紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为 1~10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、 Tris 缓冲液和某些氨基酸等。紫外吸收定氮法双缩脲法是传统的分光光度法测定蛋白质的方法,当含有两个或者两个以上肽键的物质和碱性的硫酸铜反应时,形成紫色的络合物,这个颜色产物是肽键中的氮原子和铜离子配价结合的结果。蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质。形成颜色产物的量取决于蛋白质的浓度。实际测定时,必须预先用标准蛋白质溶液制作一个标准校正曲线,通常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白质标准溶液。不同浓度的标准蛋白质溶液加入双缩脲试剂后,反应生成的颜色产物用紫外-可见分光光度计在 540nm 波长下测定吸光度,以双缩脲试剂加缓冲或水作空白对照。然后将测得的值分别对蛋白浓度(mg/ ml) 作图,得标准曲线。未知蛋白样品用双缩脲试剂做同样处理, 根据测得吸光度值在标准曲线上直接查得未知蛋白质样品中得蛋白质浓度。酚试剂法此法的显色原理与双缩脲方法是相同的,只是加入了第二种试剂,即Folin —酚试剂,以增加显色量,从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是: ?在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。?Folin —酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深蓝色(钼兰和钨兰的混合物) 。在一定的条件下,蓝色深度与蛋白的量成正比。考马斯亮蓝法考马斯亮兰 G-250 染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰的位置( ?max ) ,由 465nm 变为 595nm ,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为,染料