文档介绍：聚丙烯酰***凝胶双向电泳第一部分实验简介一、实验目的通过双向电泳实验,初步掌握电泳的基本理论、双向电泳实验的设计原理和实验技能。二、实验原理根据不同的蛋白质具有不同的分子量和等电点的特点。利用这一性质首先通过毛细管聚丙烯酰***凝胶等电聚焦技术将不同等电点的蛋白质分开,然后通过 SDS- 聚丙烯酰***凝胶电泳将相同或相近等电点而分子量不同的蛋白质进行相对分子量分离。经过二维电泳分离的蛋白质在二维电泳图谱所处的位置,就是该蛋白质的相对分子量和等电点。三、实验流程蛋白样品的制备↓等电聚焦凝胶溶液的配制↓灌注毛细管凝胶↓组装第一向电泳槽↓聚焦电泳↓停止电泳↓取出毛细管胶↓毛细管胶置平衡液中平衡↓组装第二向电泳槽↓配制 SDS- 丙烯***凝胶溶液↓灌装 SDS- 电泳胶↓第一向凝胶与第二向凝胶拼接↓接通电源进行 SDS- 电泳↓停止电泳取胶↓凝胶置固定液中固定↓银染法显色↓结果分析第二部分实验方法第一向电泳——毛细管等电聚焦电泳( IEF ) (见清单) 烧杯 1000 mL 、50 mL 各1个量筒 1000 mL (或500 mL )、 100 mL 、10 mL 各1个注射器 1 mL (带长针头)、微量注射器 100 μL(或50μL) 各1支大塑料盒 1个滴管 1支 (1) 覆盖溶液( 25 mL /班) 含8 mol/L 尿素, 1% ***电解质 pH 3~ , 5% (w/v) NP40(Nonidet P 40 Substitute) 和100 mmol /L DTT 取12 g尿素, mL ***电解质( pH 3~) , mL 的 10% 的 NP40 g DTT ,用重蒸水溶解后,定容到 25 mL 。溶液不能受热,储存在冰箱中。(2) 平衡溶液( 250 mL /班) Tris - HCl ( pH ) 缓冲液,含 2% SDS ,100 mmol /L DTT 和10% 甘油 15 mL Tris - HCl (pH ) ,50 mL 10%SDS , g DTT 和29 mL 甘油,用重蒸水定容到 250 mL ,室温存放。(3) 30% Acrylamide 第一向储液( 100 mL/ 班) 含 % ( w/v) acrylamide 和 % ( w/v) N,N'- methylene - bis - acrylamide 用重蒸水先将 g bisacrylamide 溶解后,再加入 g acrylamide ,溶解,用重蒸水定容到 100 mL 。如果溶液混浊,需要进行过滤。溶液存放在棕色瓶中, 4°C贮藏, 3~4 星期内使用。(4) 10%( w/v) NP40 ( 20mL/ 班) 配制 100 mL 溶液,称量 10 g NP40 ,用重蒸水定容到 100 mL ,室温存放。(5) 20 mmol /L NaOH 配制 500 mL , g NaOH 用蒸馏水定容到 500 mL 。(6) 10 mmol /L H 3 PO 4配制 2000 mL ,量取 mL H 3 PO 4 (85%) 用蒸馏水定容到 2000 mL 。(7) 固定液乙醇 35 mL ,三***乙酸 10 g,磺基水杨酸 g, 加蒸馏水定容到 100 mL 。(8) 脱色液乙醇 25 mL ,冰乙酸 10 mL ,加蒸馏水定容到 100 mL 。(9) 10% 过硫酸铵 g过硫酸铵溶于 1 mL 重蒸水中,在 4oC冰箱中可保存 3~4 个星期。 (1) 准备玻璃管取4支18 cm 的长玻璃管,洗净晾干。(2) 配制第一向凝胶溶液( 8 mL /4 组) 配制方法见表 1。表1 第一向凝胶溶液配方尿素 g 重蒸水 mL 30% Acrylamide 储液 mL 搅拌溶解 10% NP40 mL ***电解质( pH3~) mL 10% 过硫酸铵*15 μL TEMED *10 μL (3) 灌制第一向凝胶(每组 2人共制作 4根胶柱) 取1支1 mL 注射器和一根长针头,吸取约 mL 第一向凝胶溶液,再取 1支玻璃管,用手指垫一块封口膜堵住玻璃管的一端,将长针头全部插入玻璃管中,一边注入凝胶溶液一边后退针头,注意针头不要露出胶面, 直至凝胶溶液到达玻璃管顶端,撤出针头,用滤纸擦干玻璃管口的凝胶溶液,然后用封口膜封住该端管口,将玻璃管倒置,将长针头从玻璃管的另一端插入管内