文档介绍：实验一分光光度法测定 CuSO 4浓度生物化学和分子生物学实验 1 必须穿白大褂; 2 书包放在实验台的上层架子上; 3 实验报告在课后 24小时内由实验班长统一上交; ?值日生注意事项强调: 1 清洁实验台、讲台和试剂架; 2 用湿抹布擦黑板; 3 清洁比色皿; 4 将所有移液枪调到最大量程; (一)基本原理?分光光度法是利用物质对某种波长的光具有选择性吸收的特性建立起来的鉴别物质或测定其含量的一项技术。( 吸收特征、吸光强度) ? Lambert-Beer 定律,吸光度与溶液的浓度成正比,与光束通过溶液的距离(即光程)成正比,用数学表达式表示为: A=KLC ?C:物质的浓度(mg/ml, mol/L) ,L:光程( cm ), K为吸光系数或消光系数。互补色互补色光——如:黄光和蓝光; 红光和绿光。 CuSO 4呈蓝色是由于溶液吸收了黄光。溶液越浓,光选择吸收越多,颜色越深。?当一束平行单色光通过溶液时,一部分被吸收,一部分则透过溶液。?入射光强度为 I 0,透射光强度为 I t, ?则透光度 T= ?吸光度(A) 或称光密度(OD) 或称消光度(E) A= - lgT I 0I t A=KLC 100% ? Io It?由于单色光透过溶液时,不仅被待测物质所吸收,而且还被比色容器与溶剂以及其它试剂吸收一部分,这部分需用空白管消除; ?空白液的做法即用与样本相同的一切试剂,而不含被测定的物质。空白管(二)待测溶液的浓度计算?(1) 利用吸光系数(消光系数)求出待测溶液的浓度: ?(2) 利用标准曲线进行换算: ?(3) 利用标准管法计算待测溶液的浓度: ?若C为 1% ( g/ml ), L为 1cm ,此时的 : C=A / ?根据 Lambert-Beer 氏定律: A=KLC %11 cmE %11 cmE ?根据 Lambert-beer 定律: 标准管: As=KLCs ( 下标 S:标准液) 待测管: Ax=KLCx ( 下标 X:待测液) ?L相等,温度相同,测定同一物质,所用单色光相同,则 K相同,则: As/Ax=Cs/Cx 即 Cx=Ax/As · Cs ?在实际操作中,常使待测管体积与标准管体积相等(以X代表测定管含量, S代表标准管含量)则: X=Ax/As ·S ?计算待测溶液浓度时,可根据测定时实际吸取的标准液的体积(Vs) 和待测样品的体积(Vx) ,将上式演变为: 待测溶液浓度: Cx = 利用标准管法计算待测溶液的浓度 Vx Vs Cs As Ax??(三)波长的选择(三)波长的选择?波长的选择一般是选择待测物质最大吸收峰的波长(λ max ) 。?根据下列三个原则: ,一般而言,适当的光密度为 — ,而以 — 最理想。过低的光密度因仪器的读数误差而产生很大的相对误差, 反之,过高的光密度则往往已超过直线范围而引入误差。 。在反应中,如遇不易去除的干扰色泽,应选用对此干扰色泽最不灵敏的波长。 。