文档介绍：温州医学院硕士学位论文 A2A腺苷受体基因敲除对小鼠视网膜新生血管形成的影响中文摘要目的腺苷是腺嘌呤核苷酸代谢的中间产物,广泛存在于全身各组织中,在组织缺氧时由ATP大量分解产生。心、脑、肾等组织急性缺氧时,腺苷作用于局部组织产生明显的扩血管作用,改善血供;组织慢性缺氧时,腺苷通过直接或间接的作用,促进组织新生血管生成,有积极的代偿作用。视网膜缺氧时也会产生视网膜新生血管,但后者严重威胁和破环视网膜功能,是目前致盲性眼病的主要原因之一。抑制新生血管生长是治疗此类增生性视网膜病变的关键。腺苷在视网膜组织的生理作用目前还不是很清楚。近年来一系列体内体外实验证实腺苷作用于细胞膜上的特异性腺苷受体,刺激内皮细胞的增殖和迁移,对新生血管的生成有促进作用。因此腺苷受体的缺失会影响血管生成和发育。现已证实腺苷A2A受体在视网膜组织表达。本研究通过建立高氧诱导的视网膜病变模型(Oxygen-induced retinopathy,OIR),结合视网膜铺片及切片技术、免疫组化标记和分子生物学方法,深入研究A2A受体基因敲除对OIR模型的视网膜病变的影响,以揭示A2A 受体在相对缺氧条件下对视网膜新生血管形成的影响。方法实验动物:选用遗传背景C57BL/6的野生型(A2A+/+)和基因敲除型(A2A-/-) 小鼠,均来自A2A基因敲除杂合子(A2A+/-)雌雄小鼠交配。小鼠的基因型鉴定采用PeR方法。实验分组:1、建立高氧诱导的视网膜病变模型,设立野生型空气组和氧诱导组;2、研究A2A受体基因敲除对小鼠视网膜血管的影响,设立基因敲除空气组和氧诱导组。建立模型:选取7日龄健康小鼠,随机分为4组:野生型空气组、氧诱导组和基因敲除空气组和氧诱导组,每组40只。空气组于正常空气环境中饲养,氧诱导组置于氧气浓度为(75%±2%)的氧箱中,5整天后(即于生后第12天, Postnatal 12days,P12)返回正常空气环境中饲养,建立高氧诱导的视网膜病 2 温州医学院硕士学位论文变动物模型。病理组织学检查:各组小鼠分别于出生P12、P14、P17,和P21处死,取眼球。右眼行视网膜铺片经ADP酶染色,以观察视网膜血管形态改变;左眼行视网膜组织连续切片经HE染色,计数内丛状层以内非神经节细胞数和突破内界膜细胞核数,以定量评估视网膜的增生反应。免疫组织化学检查:A、CD31、GFAP等免疫组化方法鉴别非神经节细胞类型。PCNA标记增殖期细胞,CD31标记成熟的血管内皮细胞,GFAP标记成熟星型胶质细胞。定量PCR技术:通过实时荧光定量PCR技术检测视网膜组织VEGFmRNA表达。 B-actin基因在不同样本组织中的表达量处于稳定状态,故可以将其基因产物的含量作为定量VEGF的内参照物,并可以此来校正标本之间RNA的质量和逆转录效率的差异。本研究将VEGFmRNA的拷贝数与相对应的B-actin基因的拷贝数相除来进行标准化,从而得出VEGF基因产物的相对定量。结果1、与17日龄空气对照组相比,同日龄野生型氧诱导组小鼠视网膜血管迂曲扩张,大片无血管区形成,新生血管开始形成;非神经节细胞数和突破内界膜的细胞核数均比空气组显著增加(P<,n=20)。表明氧诱导视网膜病变模型建立成功。 2、与同日龄野生型氧诱导组相比,基因敲除型氧诱导组无血管区面积明显减少,未见新生血管。非神经节细胞数和突破内界膜的细胞核数分别下降了40 %和80%,差别有显著性意义(P<,n=20)。基因敲除空气组与野生型空气组相比均无显著性差别(P>,n=20)。 3、PCNA免疫组化染色表明氧诱导组小鼠视网膜中的绝大多数的非神经节细胞和突破内界膜的细胞为增殖细胞;CD31和GFAP免疫组化染色表明在非神经节细胞和突破内界膜的细胞中包括血管内皮细胞、星型胶质细胞。 4、VEGFmRNA的实时荧光定量PCR结果显示:与同龄的空气组比较,野生型氧诱导组VEGFmRNA水平表达上调,两者差异有显著性意义(P<,n=8);而温州医学院硕士学位论文基因敲除型氧诱导组的VEGFmRNA水平明显低于野生型氧诱导组,两组比较差异十分显著(P<,n=8)。提示A2A受体基因敲除下调VEGFmRNA的表达。结论1、A2A受体基因敲除能在一定程度上抑制缺氧引起的视网膜病变,减少视网膜新生血管形成,提示A2A受体可能在早产儿视网膜病变发病机制中发挥重要作用。A2A受体拮抗剂有望成为预防血管增生性视网膜病变的一种潜在的药物。 2、A2A受体基因敲除下调VEGF的表达,提示腺苷是通过上调VEGF的表达影响血管的形成和发育。关键词小鼠;腺苷A2A受体;早产儿视网膜病变(RoP);血管内皮生长因子(VEGF);基因敲除 4 温州医学院硕士学位论文 Attenuated Hypoxia