文档介绍：实时荧光定量PCR技术
所谓real-time FQ-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
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是一种完全闭管式的PCR和荧光探针杂交技术相结合的定量PCR方法。
PCR的高效扩增特性
核酸探针的高特异性
光谱技术的高灵敏性和可计量性
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实时荧光定量PCR
定义
利用荧光信号对PCR反应的过程进行实时监控
目的
对起始模板进行定量
优点
灵敏，重复性，动态范围宽，高通量
原理
Ct 值与起始模板浓度的对数成比例
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实时荧光定量PCR原理
PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。
在传统的PCR 中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。
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利用电泳定量
11,500 counts / 5200 counts = fold difference
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实时荧光定量PCR原理
在real-time Q-PCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。
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实时荧光定量PCR原理
在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点 上来检测PCR产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。
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实时荧光定量PCR原理
为了便于对所检测样本进行比较，在real-time Q-PCR反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值（threshold）。
以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号 （baseline），荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
threshold = 10 ´ SDcycle 6-15
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实时荧光定量PCR原理
如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数（Ct）。
Ct值的含义是：
每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。
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什么是C(t)值
C(t)
Threshold（域值）
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