文档介绍：1
基因工程（上游）大体步骤
获取目的基因
目的基因与载体连接
连接产物导入细胞
目的基因表达
逆转录PCR法
PCR法
直接调用法
各种质粒
各种病毒
皆经改造
原核细胞
真核细胞
哺乳动物细胞
植物细胞
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第一节 获得目的基因
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直接分离目的DNA
经限制酶切割，电泳分离DNA片断。
适用于获得细菌、质粒、病毒等低等生物的基因片段。
真核生物的染色体DNA中含有内含子序列，不适合于基因工程的需要。
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2. cDNA文库
The cDNA library :contains only complementary DNA molecules synthesized from mRNA molecules in a cell.
以mRNA为模板，逆转录合成的互补DNA。以此得到的某种细胞内所有mRNA的cDNA，称为cDNA文库。
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3. RT-PCR
基本原理：
将细胞中mRNA逆转录为cDNA，以cDNA
为模板，进行PCR反应。
mRNA
cDNA
PCR产物
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第二节
重组DNA分子的构建
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Link of cohesive end
粘末端连接
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Link of blunt end
平末端连接
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平末端连接
Recombinant DNA
T4 DNA ligase
vector
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平末端连接的缺点
*more difficult ligation 连接困难
*2-direction insertion 双向插入
*self-reconnection 自身环化
*no easy way of retrieving the insert
重新筛选插入的片断困难
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