文档介绍：实验九酶联免疫吸附试验-ELISA 实验十 IgG 的分离和纯化程燕 2014 年6月9日实验九酶联免疫吸附试( Enzyme linked immunosorbent assay , ELISA ) 实验目的 1. 掌握酶联免疫吸附试验的原理、种类和用途。 ( HBsAg )的方法。 HBsAg 阳性的意义。实验原理?用酶来标记抗原或抗体的免疫分析分析技术。由于酶的高效生物催化作用,产生了放大作用,使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来,这种技术被称为酶联免疫吸附试验法。实验原理将已知抗体(或抗原)结合在某种固相载体上,并保持其免疫活性。测定时将待检标本和酶标抗体(或酶标抗原) 按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体(或抗原) 发生反应,用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离物成分,然后加入底物显色,进行定性或定量测定。实验原理 ELISA 的基本原理有三条: (1)抗原或抗体能以物理性(疏水性)地吸附于固相载体表面, 并保持其免疫学活性; (2)抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性; (3)酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在,而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的,因此,可以按底物显色的程度显示试验结果。实验原理常用酶联免疫吸附试验有间接法竞争法双抗体夹心法 ELISA- 间接法?此法是检测抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体上,加入待测血清(抗体) 与之结合, 洗涤后,加酶标抗体和底物进行测定。其原理见图。酶标抗体固相抗原待测抗体 E E E ELISA 间接法示意图底物底物?用于抗原及半抗原的定量测定,也可用于测定抗体。?以测定抗原为例,将特异性抗体吸附于固相载体上, 加入待测抗原和一定量的已知酶标抗原,使二者竞争地与固相抗体结合,经过洗涤分离,最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。固相抗体 EE E 酶标抗原待测抗原 E底物 E显色反应(弱) 固相抗体 EE E酶标抗原底物显色反应(强) E EE E EEELISA- 竞争法 ELISA- 双抗体夹心法?双抗体夹心法常用于检测抗原。?将已知抗体吸附于固相载体,加入待测标本( 含相应抗原) 与之结合,温育后洗涤, 加入酶标抗体及底物溶液进行测定。酶标抗体固相抗体待测抗原 E E E 双抗体夹心法检测抗原