文档介绍：\煳燃慢性肾衰对脂肪组织肾素一血管紧张素系统的活化及机制硕士研究生:徐国玉指导教师:侯凡凡教授周秋根副教授摘要第一部分慢性肾衰对脂肪组织肾素一血管紧张素系统的活化及机制研究背景慢性’肾功能不全(CRF)是一种慢性炎症性疾病,脂肪组织是其炎症反应的一个主要来源【1]。脂肪组织不仅是机体重要的能量储存场所,而且还可以合成和分泌大量的脂肪因子,如细胞因子、急性期反应蛋白、趋化因子等[2]。研究发现:慢性肾功能不全时,脂肪组织释放大量的脂肪因子,引起全身炎症反应和氧化应激,进而促进了慢性肾衰一系列并发症的发生[1】。长期以来,人们认为肾素一血管紧张素系统(RAS)仅调节着收缩压和肾脏电解质的平衡,但近些年研究发现,。肾素一血管紧张素系统的多种成分也表达于多种组织中,如:肾上腺、。肾脏、脑、心脏和血管中[3]。局部RAS可通过调节基因表达、促进增生、纤维化及炎症反应,进而调节局部器官的生理学功能。自1987年研究发现大鼠主动脉周围脂肪组织有AGTmRNA的表达后,大量关于脂肪组织局部亦表达RAS的研究开展起来。研究发现,大鼠和人的脂肪组织中表达合成血管紧张素I I所需的所有成分,包括血管紧张素原(AGT)、血管紧张素转化酶(ACE)和血管紧张素I型受体(ATl)等[4]。进一步的研究还证实,局部RAS可影响脂肪组织的生物学活性和代谢功能,如:血管紧张素II通过与其受体结合,可以抑制脂质分解和促进脂质合成,进而促进了脂摘要肪组织脂质的蓄积;血管紧张素I I抑制前脂肪细胞的分化,减少脂肪细胞的数量,促进脂肪细胞的肥大;血管紧张素I I还促进炎症因子的释放,引起脂肪组织炎症反应和重塑。局部肾素一血管紧张素系统不仅对脂肪组织局部发挥着重要作用,对机体全身也产生着巨大影响,如引起脂质代谢异常、高血压、胰岛素抵抗和其他部位炎症性疾病,包括动脉粥样硬化、炎症性肺疾病、肾衰竭和肿瘤等[5]。我们之前的研究已发现慢性肾衰时脂肪组织存在明显的炎症反应,但其具体机制尚不清楚。为探讨脂肪组织的RAS是否参与此过程,我们首先测定了慢性肾衰时脂肪组织RAS的表达情况。 4一羟基2一壬烯(HNE)是脂质过氧化的终末产物,在终末期肾衰的病人中常升高;本实验室也已证实慢性肾衰大鼠皮下和内脏脂肪组织高表达HNE蛋白。脂肪细胞HNE的蓄积可引起脂联素的合成减少[6]及慢性炎症的发生[7】。研究证实,HNE可以促进Toll样受体(TLRs)的表达,引起一系列的病理改变【8];终末期肾衰病人单核细胞和白细胞中TLRs表达也增多,那么慢性肾衰时,HNE是否通过TLRs引起RAS活化尚不清楚。体内实验,5/6肾切除大鼠作为慢性肾功能衰竭模型,观察脂肪组织是否存在肾素一血管紧张素系统的活化。目的在于探讨慢性肾衰时脂肪组织炎症反应的发生机制。体外实验,,观察HNE是否可诱导肾素一血管紧张素系统的活化;阻断TLRs的表达,观察HNE刺激RAS的活化是否受抑制,即探讨HNE活化RAS的可能机制。研究方法体内部分一、二步法5/6肾切除建立慢性肾衰模型 1)腹腔注射麻醉大鼠:给大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉,俯卧位定于硕士学位论文鼠台上。 2)酒精消毒,于大鼠左腹部中1/3脊柱旁开2-3cm处行纵行切口,切口长度约为2-3cm。 3)依次切开皮肤和皮下组织,并剪开肌肉暴露肾脏,剥离肾包膜,用无损伤血管钳夹住肾蒂,切除肾脏的上下极约占左肾的2/3,明胶海绵压紧上下极创面止血,放松血管钳,观察创面不再渗血后还纳肾脏回腹腔,逐层缝合肌层及皮肤,酒精消毒手术切口。缝合前,腹腔内滴注青霉素注射液,预防感染。假手术组只做肾包膜剥离术。 4)一周后,在脊柱右侧中1/3旁开2-3cm纵行切口(切口略高于左侧), 分离肌层,游离。肾脏,无损伤血管钳夹住肾蒂,4号丝线结扎肾蒂,切除右侧肾脏,观察有无出血,缝合肌层和皮肤,酒精消毒手术切口。假手术组只做肾包膜剥离术。二、大鼠血、尿和脂肪组织的留取及处理 1)术后第16周,测定大鼠血压后将大鼠放于代谢笼中,留取24小时尿。 2)腹腔注射麻醉大鼠:给大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉,仰卧位固定于鼠台上 3)腹主动脉采血后,采用放血法处死大鼠。 4)酒精消毒皮肤,分离附睾和腹膜后脂肪垫(内脏脂肪)及腹股沟脂肪垫(皮下脂肪),迅速放入盛有1xPBS()的培养皿中。 5)PBS反复清洗脂肪垫,剔除肉眼可见的血管,将脂肪垫剪成小块,包于锡箔纸中,液氮速冻,一80℃保存。三、脂肪组织肾素一血管紧张素系统指标ATl蛋白活性的检测 Sham组和CRF组大鼠皮下和内脏脂肪组织,按组织重量:裂解液=1:4的比例用匀浆器反复上下匀浆,以上操作均在冰上进行,匀浆完全后,130009,4。C 离心40min,去掉漂浮于上层的脂滴,提取中间层的匀浆液,即为