文档介绍：第六章基因文库的构建生物科学与技术学院基因文库○基因文库(gene library )——也称 DNA 文库,是指某一生物体全部或部分基因的集合。具体来讲,某个生物的基因组 DNA 或cDNA 片段与适当的载体在体外重组后,转化宿主细胞,并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体),所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。○用于基因克隆的 DNA 材料的来源?从特定组织提取的染色体基因组 DNA--- 基因组文库? mRNA 反转录成的 cDNA 拷贝---- cDNA 文库○用于基因克隆的 DNA 材料的选择?如果研究的目标是弄清一种蛋白质的氨基酸顺序,可以根据克隆的 cDNA 分子的核苷酸序列的结构直接推导出来; ?如果要研究的是控制基因表达活动的调控序列,或是在 mRNA 中不存在的某种特定序列,有关这类的信息就只能从染色体基因组 DNA 中获得。第一节基因组文库的构建基因组文库(GENOMIC LIBRARY) ?定义:某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体储存于某一受体菌的群体中,这个群体就称为该生物基因组的文库。即指将某生物体的全部基因组 DNA 用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的 DNA 片段, 再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落或噬菌斑。?目的: a)分离有用的目的基因 b)保存某种生物的全部基因?基因组 DNA 文库的类型构建基因文库的载体类型决定了插入片段的大小和用途。每类载体适合构建不同的基因文库,满足不同的研究目的。 1、质粒文库?质粒载体是最早用于构建基因组文库的载体。?质粒载体所容纳的外源 DNA 片段一般在 10kb 以内。?质粒文库一般应用于构建亚克隆文库或亚基因组文库。 2、噬菌体文库?λ噬菌体载体是噬菌体文库中应用最广泛的载体,其利于用分子杂交的方法进行筛选,因此常用于构建小基因组物种的基因克隆。?M13 单链噬菌体载体一般用于构建 BAC 和PAC 亚克隆文库或 cDNA 文库。 3、黏粒文库(柯斯质粒文库) ?黏粒载体与噬菌体载体类似。?主要用于构建小基因组物种的基因组 DNA 文库。有时也用于构建大基因组物种的基因组 DNA 文库,利用他们在筛选上的优势来分离单个基因或构建一定区间范围的亚基因组 DNA 文库。 4、人工染色体文库?也称为大片段基因组 DNA 文库,容纳的外源 DNA 片段为 100kb- 1Mb 。?主要用于大基因组物种的基因克隆、物理图谱构建和基因组测序等。 5、亚基因组文库?亚基因组文库是相对于基因组文库提出的,文库的对象不是全基因组范围,而是基因组的某一区段,如基因组 DNA 某一特定大小酶切片段的组合、一条染色体或更小的区段。?一般而言,亚基因组文库主要应用在基因组较小的物种基因克隆和大基因组物种的后期研究。?文库的代表性和随机性?为保证能从基因组文库中筛选到某个特定的基因,基因组文库必须具有一定的代表性和随机性。?代表性指文库中所有克隆所携带的 DNA 片段可以覆盖整个基因组,也就是说,可以从文库中分离任何一段基因组 DNA 。代表性是衡量文库质量的一个重要指标。?采用部分酶切或随机切割的方法来打断染色体 DNA ,以保证克隆的随机性,使包装每段基因组 DNA 在文库中出现的频率均等。一、原核生物基因组 DNA 的提取染色体 DNA 质粒 DNA 要求:制备的 DNA 的长度为 100-200kb ,防止在制备过程中的机械断裂二、基因组 DNA 的不完全酶切?1、根据实验需要选择合适的限制性内切酶? a) 四个识别位点的限制酶出现的几率: 1/256 ? b) 六个识别位点的限制酶出现的几率: 1/1024 ?2、分离目的酶切片段大小的确定? a) 克隆单个基因: < 10 kb ? b) 克隆基因族: < 20kb ?3、 DNA 不完全酶切条件的确定? a) 确定限制酶用量,改变酶切时间? b) 固定酶切时间,改变限制酶的用量基因组文库构建的步骤 4、克隆片段的大小与构建文库克隆子的关系以人?-珠蛋白基因为例,其大小约为 ,而人的单倍体基因组总长度达 3? 10 6 kb 左右。?理论克隆数:文库理论克隆子数=基因组 DNA 总长/DNA片段平均长度, 则: 3? 10 6 / = ?实际克隆数:由于 DNA 片段是随机克隆的,因此理论值只是基因组基因文库所需要的最小数值。从统计学上讲,一个完全的基因文库就必须含有 3-10 倍于最低重组体克隆数的克隆。? 1975 年, L. Clarke 和 J. Carbon 提出了一种计算一个完全基因文库需要实际克隆数的公式。文库实际克隆子数(N) =ln(1-p) /ln(1- f),f= DNA 片段平均