文档介绍：实验动物若干免疫功能或指标的检测免疫学实验目的和内容?目的:掌握常见的免疫功能测定方法。?内容:一、直接免疫荧光法测定T细胞亚群。二、淋巴细胞的分离和E花环试验。三、ELISA测定特异性抗体。免疫学实验的时间安排?直接免疫荧光法测定T细胞亚群(1月5日上午)。?淋巴细胞的分离和E花环试验(1月5日下午)。?ELISA测定血清中的特异性抗体、完成实验报告(1月6日上午)。直接免疫荧光法测定T细胞亚群?原理:根据T细胞膜表面的CD分子不同,可将其分为 CD4+T细胞亚群和CD8+T细胞亚群。?试验:已知荧光素标记的抗小鼠CD4抗体或抗小鼠CD8 抗体与小鼠淋巴细胞表面的相应CD分子结合, 在荧光显微镜下计数荧光阳性细胞,从而确定T 细胞亚群的百分率。主要试剂和仪器?鼠淋巴细胞:来源于昆明鼠的脾脏,每组5 人,每组1只小鼠。?荧光素FITC标记的抗小鼠CD4抗体: ?荧光素PE标记的抗小鼠CD8抗体: ?载玻片、血球计数器、水平离心机、普通光学显微镜、荧光显微镜等。?Hank’s液、PBS-%BSA、1:1PBS-甘油。操作步骤一?脾细胞悬液的制备:通过颈椎脱位处死小鼠,处死的小鼠置70%乙醇中浸泡3-5 min,取鼠脾脏置于含有Hank’s液的平皿中,于金属网上研压,收集小鼠脾细胞悬液,细胞悬液离心1500r/10min,弃上清。?细胞的悬浮:加入5mlHank’s液,轻柔悬浮细胞。操作步骤二?细胞的计数:用Hanks平衡盐溶液恰当定容细胞(5ml、 20倍稀释),在血细胞计数板上于低倍镜计数。?计算的公式:根据公式求出每毫升细胞数(必要时进行细胞活力测定)。?细胞的浓度:最后用PBS-%BSA 调整细胞浓度为 5×10 6细胞/ml。操作步骤三?标记抗体:每组取两只小试管,加入1ml上述脾细胞悬液, 离心1500r/5min,弃上清,分别加入荧光素标记的抗小鼠CD8或CD4抗体100μl,使用滴管轻轻的吹打细胞, 使其混匀,室温避光反应20min。?细胞洗涤:PBS-%BSA洗涤一次,离心1500r/5min。?显微镜的检查:弃上清,加入100μlPBS-甘油,吹打细胞, 悬液滴至载玻片,覆以盖玻片,荧光显微镜下观察。注意事项?小心的处理细胞:使用滴管轻轻的吹打细胞。?准确的细胞计数:根据公式、合理应用。?荧光抗体的处理:尽量避光,防止淬灭。淋巴细胞的分离?原理:根据细胞比重的不同,进行淋巴细胞的初步分离。?材料:来源于人类的外周血,其中人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)包含淋巴细胞和单核细胞。