文档介绍：流式检测凋亡的讨论
2010-07-15 14:28 来源：丁香园点击次数：15397关键词：流式检测凋亡
关于凋亡的流式检测
wanhood
一、PI单染色法
基本原理
其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细 胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主 要包括以下几个方面：
细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改 变。研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。许多学者把这 种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。
光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上，前散射光与细胞的 大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞 固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之。此外细胞凋亡时由于染 色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时，由于细胞肿胀, 其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细 胞。但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核 胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋 亡中，其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免 疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用于活细胞的分类。
试剂与仪器
PBS溶液(配制方法见附录)；
PI染液：将PI溶于PBS ()中，终浓度为100ug/ml。用棕色瓶4°C避光保存。
70%乙醇
400目筛网
流式细胞仪
实验步骤
收集细胞{数目约（1~5）对06个/mL} , 500 - 1000 r/min离心5min,弃去培养液。
PBS 洗涤 1 次。
离心去PBS,加入冰预冷的70%的乙醇固定，4°C, 1—2小时。
离心弃去固定液，3mlPBS重悬5min„
，500—1000r/min离心5min,弃去PBS。
用1ml PI染液染色，4莒避光30min»
流式细胞仪检测：PI用***离子激发荧光，激光光波波长为488nm,发射光波波长大于630nm,产 生红色荧光分析PI荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。
结果判断：在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上，凋亡细胞与正常细胞相比，前散射光降低， 而侧散射光可高可低，与细胞的类型有关；在分析PI荧光的直方图时，先用门技术排除成双或聚集的细胞 以及发微弱荧光的细胞碎片，在PI荧光的直方图上，凋亡细胞在G1/G0期前出现一亚二倍体峰。如以G1/G0 ,,可用鸡和姓 鱼的红细胞的PI荧光强度做参照标准， 完整的细胞。
注意事项
细胞凋亡时，其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种DNA可染性降低也可能是 因为DNA含量的降低，或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时 应该注意。
二、Heochst 33342/PI 双染色法
基本原理经固定的凋亡细胞其染色体荧光染料的DNA可染性性下降。细胞一经固定就不再是活细胞, 而且细胞固定过程对细胞膜的通透性也有影响。因此发展了用“细胞活性”鉴定染料染色的流式细胞仪检测 方法。这些方法细胞不经固定就直接用DNA染料染色，且染料的浓度要比固定细胞所用的浓度要低得多。 流式细胞仪通常根据细胞膜完整性将细胞分为“活细胞”和“死细胞”，因此正常细胞和凋亡细胞归为活细胞。 活细胞染料如Hoechst 33342能少许进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。Hoechst 33342在 凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高，Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度增高的机制与凋亡 细胞膜通透性发生改变有关，凋亡细胞早期细胞膜的完整性没有明显性改变，但细胞膜的通透性已有增强, 因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342比正常细胞的多。此外，还与凋亡细胞的染色体DNA的结构发生 了改变从而使该染料能更有效地与DNA结合以及凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将 Hoechst 33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等有关。既然Hoechs