文档介绍：实验一血清蛋白电泳( 醋酸纤维薄膜法) [ 目的] 了解电泳法分离蛋白质的原理、操作方法及临床意义。[ 原理] 带电荷的蛋白质, 在电场中向着与其所带电荷电性相反的电极泳动称为电泳。血清中各种蛋白质的等电点不同, 但大都在 pH7 以下, 若将血清置于 的缓冲液中, 则这些蛋白质均带负电, 在电场中都向阳极移动。由于各种蛋白质在同一 pH 环境中所带负电荷多少及分子大小不同, 所以在电场中向阳极泳动速度也不同。蛋白质分子小而带电荷多者, 泳动速度快; 反之, 则泳动速度慢。因此可将血清蛋白质依次分为清蛋白、 a 1- 球蛋白、 a 2- 球蛋白、 b- 球蛋白和 g 球蛋白五条区带,经染色可计算出各血清蛋白质含量的百分数。醋酸纤维薄膜电泳具有微量、快速、简便及分辨率较高等优点, 广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、同工酶的分离和测定。[ 仪器与材料]1 .仪器:电泳仪、电泳槽、分光光度计或光密度仪。 2 .材料:醋酸纤维薄膜、培养皿、滤纸、镊子、点样器、直尺、铅笔、剪刀等。[ 试剂]1 .巴比妥—巴比妥钠缓冲液( , m=) 。称取巴比妥 克和巴比妥钠 克,溶于 500 毫升蒸馏水中,加热溶解。待冷至室温后,再加蒸馏水稀释至 1000 毫升。 2 .染色液。称取丽春红 克及三***醋酸 6 克;用蒸馏水溶解,并稀释至 100 毫升。 3 .漂洗液。 3%(V / V) 醋酸溶液。 4 .透明液。取无水乙醇 75 毫升和冰醋酸 25 毫升混匀备用。 5. /L 氢氧化钠溶液。 6. 40%(V / V) 醋酸溶液。[ 操作]1. 薄膜的准备: 取醋纤薄膜(2 厘米*8 厘米) 在毛面的一端约 厘米处, 用铅笔轻划一直线, 表露点样位置并编号。然后将此薄膜置于巴比妥缓冲液中浸泡,待充分浸透( 即膜条无白斑时) 后取出,用洁净滤纸轻轻吸去表面的多余缓冲液。 2. 点样。取少量血清置于普通玻璃板上, 用点样器的钢口蘸取血清(约 3~5ml) , 随后将钢口垂直“印”在点样线上, 待血清渗入膜后移开点样器。点样应注意, 要适量、均匀和垂直, 并避免弄破薄膜。 3. 平衡与电泳。将已点样的薄膜加样面朝下, 加样端置于阴极端, 平整地贴于电泳槽的支架上拉直。支架上事先放置好两端浸入缓冲液的用四层滤纸条作的“滤纸桥”( 如图 2)。平衡数分钟至薄膜重又湿润时方可通电进行电泳。一般电压为 120~160 伏,电流约 ~ 毫安/厘米, 通电时间 40~50 分钟,待电泳区带展开约 厘米时断电。 4 .染色。小心取出薄膜,直接浸于丽春红 S 染色剂中 5~10 分钟( 以清蛋白区带染透为止)。然后在漂洗液中连续浸洗数次, 使薄膜底色漂净, 即得五条蛋白色带。从阳极端起依次为清蛋白、 a 1、a 2、b和 g- 球蛋白。 5. 透明。若要保存薄膜, 待薄膜完全干燥后,