文档介绍:基因工程的主要操作技术及原理
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DNA提取
总DNA提取
1、植物总DNA提取
2、动物总DNA提取
3、大肠杆菌总DNA提取
4、质粒DNA提取
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总DNA提取
DNA的应用
构建基因组文库:100kb
Southern杂交(包括RFLP) 50kb
PCR分离基因等 50kb
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因材施提
根据不同研究需要,保证结构的相应完整性
尽量排除其它大分子成分的污染(蛋白质、多糖及RNA等)
保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子
在DNA提取过程中应做到
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1、植物细胞总DNA提取
总原则:
取材(尽量新鲜)------液氮研磨-------裂解------去蛋白和细胞物-------浓缩。
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(1)CTAB法:CTAB (cetyltriethyl ammonium bromide) (十六烷基三***溴化铵)
原理: CTAB是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜并能与核酸形成复合物,该复合物在高盐溶液中( NaCl)是可溶的, NaCl时,从溶液中沉淀,通过离心就可将其与蛋白,多糖类物质分开,在经过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA。
CTAB溶于乙醇或异丙醇进而除去 在高离子强度的溶液中(> NaCl), CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,不能沉淀核酸。
CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出,因此,在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15℃。另外,它还能保护DNA不受内源核酸酶的降解。
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高盐提取---低盐沉淀---高盐溶解----乙醇沉淀
经典的CTAB法使用两种缓冲液,
高盐提取缓冲液:1%(冷冻干燥材料)或2%CTAB(新鲜材料)、 NaCl
沉淀缓冲液:1%CTAB,不含Nacl
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操作步骤
1、取幼嫩的植物叶片(3-5g)剪碎液氮研磨成粉,。加入等体积的65℃预热的DNA提取缓冲液置于65℃的恒温水浴摇床上1-2h()。
2、加入等体积的***仿:异戊醇(24:1),轻轻上下颠倒5分钟,静置5分钟,之后于12000rpm离心10分钟。 3、吸取上层水相,重复步骤2一次。
4、吸取上层水相,加入预冷2/3体积的异丙醇,轻缓颠倒2分钟并置-20℃冰箱内10min,待DNA沉淀后于12000rpm离心收集,收集的DNA于70%乙醇中洗2-3次。将弃去乙醇风干后的DNA加适量水使其溶解。
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5、待DNA完全溶解后加入1-2μl不含RNAaseA(10mg/ml),37℃保温1h以除去DNA中的RNA。 6、于Eppendorf管中加入1mL***仿:异戊醇(24:1)轻轻上下颠倒10分钟后10000rpm离心10分钟。
7、吸取上层水相并先后加入1/10体积的3M醋酸钠及2倍总体积的预冷的无水乙醇,接着置于-20℃冰箱,10分钟后10000rpm离心10分钟,弃去无水乙醇,加入70%乙醇洗涤2-3次,风干,最后将DNA溶于适量(200-500μl) TE中。
8、待DNA完全溶解后进行1%琼脂糖凝胶电泳,检查DNA的质量并据已知的DNA 分子量标准估计其浓度。调整浓度后的DNA置于-20℃备用。
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CTAB法的优点
能很好地去除糖类杂质对于含糖较高的材料可优先使用。
在提取时能同时得到高质量的DNA及RNA。可根据需要分别进行纯化,如只需要DNA,则可用RNase(核糖核酸酶)水解掉RNA。
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