文档介绍：170 〔Ⅱ〕实验部分实验一蛋白质含量测定法本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和优缺点。蛋白质含量测定法, 是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法, 即定氮法, 双缩尿法( Biuret 法)、 Folin -酚试剂法( Lowr y 法) 和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法, 即考马斯亮蓝法( Bradford 法)。其中 Bradford 法和 Lowry 法灵敏度最高, 比紫外吸收法灵敏 10~20 倍,比 Biuret 法灵敏 100 倍以上。定氮法虽然比较复杂, 但较准确, 往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是, 这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质, 因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定, 有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的, 都有其优缺点。在选择方法时应考虑:①实验对测定所要求的灵敏度和精确度; ②蛋白质的性质; ③溶液中存在的干扰物质; ④测定所要花费的时间。考马斯亮蓝法( Bradford 法) ,由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用。一、微量凯氏( Kjeldahl )定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化) ,氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨, 借蒸汽将氨蒸至酸液中, 根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下: CH 2 COOH ?+ 3H 2 SO 4? 2CO 2+ 3SO 2 +4H 2O +NH 3 (1) NH 2 2NH 3+H 2 SO 4?(NH 4) 2 SO 4 (2) (NH 4) 2 SO 4+ 2NaOH ? 2H 2O +Na 2 SO 4+ 2NH 3 (3) 反应( 1)、(2) 在凯氏瓶内完成,反应( 3 )在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化, 可以加入 C uSO 4 作催化剂,K 2 SO 4 以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量,如欲求得样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白 171 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以 6. 25 即得。五种蛋白质测定方法比较如下: 方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法( Kjedah l 法) 灵敏度低, 适用于 ~ 氮, 误差为?2% 费时 8~10 小时将蛋白氮转化为氨,用酸吸收后滴定非蛋白氮(可用三***乙酸沉淀蛋白质而分离) 用于标准蛋白质含量的准确测定; 干扰少; 费时太长双缩脲法( Biure t法) 灵敏度低 1~ 20mg 中速 20~3 0 分钟多肽键+碱性 Cu 2 +?紫色络合物硫酸铵; Tri s 缓冲液; 某些氨基酸用于快速测定,但不太灵敏;不同蛋白质显色相似紫外吸收法较为灵敏 50~ 100 ?g 快速 5~10 分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在 280n m 处的光吸收各种嘌吟和嘧啶; 各种核苷酸用于层析柱流出液的检测; 核酸的吸收可以校正 Folin -酚试剂法( Lowr y 法) 灵敏度高~5 ?g 慢速 40~ 60 分钟双缩脲反应; 磷钼酸-磷钨酸试剂被 Ty r和 Phe 还原硫酸铵; Tri s 缓冲液; 甘氨酸; 各种硫醇耗费时间长; 操作要严格计时; 颜色深浅随不同蛋白质变化考马斯亮蓝法( Bradfor d法) 灵敏度最高 1~5?g 快速 5~15 分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时,其? ma x由 465nm 变为 595nm 强碱性缓冲液; TritonX-100 ; SDS 最好的方法; 干扰物质少; 颜色稳定; 颜色深浅随不同蛋白质变化 172 二、双缩脲法( Biuret 法) (一)实验原理双缩脲( NH 3 CONHCONH 3) 是两个分子脲经 180 ℃左右加热, 放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中, 双缩脲与 CuSO 4 形成紫色络合物, 称为双缩脲反应。凡具有两个酰***基或两个直接连接的肽键, 或能过一个中间碳原子相连的肽键, 这类化合物都有双缩脲反应。 H 2O O=C C=O HN NH R-CH CH-R O=C Cu C=O HN NH R-CH CH-R H 2O 紫色络合物紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关, 故可用来测定蛋白质含量。测定范围为 1~10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、 Tris 缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速, 但并不需要十分精确