顺铂对结肠癌细胞株HCT116凋亡及存活素表达的影响.docx

文档介绍：顺铂对结肠癌细胞株HCT116凋亡及存活素表达的影响
 
 
                        作者：陈贻平 欧阳范献 翁敬飚 
【摘要】   目的 探讨结肠癌细胞株HCT116对化疗药物顺铂不敏感的原因与机制。方法 观察不同浓度顺铂(、、、、 μg/ml) 对HCT116细胞凋亡及低浓度顺铂对抗凋亡基因存活素(survivin)mRNA及蛋白表达的影响，用流式细胞仪检测凋亡率;荧光定量PCR检测survivin mRNA的表达;Western印迹法检测survivin蛋白的表达。结果 高浓度 (、10 μg/ml)顺铂对HCT116细胞有较强促进凋亡作用，而低浓度 (、、 μg/ml)顺铂干预24 h后，促进细胞凋亡的作用不明显;HCT μg/ml顺铂作用下， survivin mRNA及蛋白表达在24 h均有明显升高。结论 顺铂可诱导HCT116细胞的凋亡，但该细胞对低浓度顺铂不敏感。survivin表达增高可能是HCT116细胞对顺铂细胞毒性药物作用不敏感的原因之一。
【关键词】   顺铂;细胞凋亡;存活素
            结肠癌化疗疗效尚不令人满意，原因主要为癌细胞对化疗药物作用的敏感性差〔1〕。为此，本实验将常用化疗药物顺铂(cisplatin)设为5个不同作用浓度，通过检测HCT116细胞在顺铂作用过程中的凋亡情况及相关基因存活素(survivin)的表达变化，探讨结肠癌细胞对细胞毒性药物顺铂作用不敏感的原因及可能机制。
　　 1 材料与方法
　　 试剂 DMEM、Trizol(Invitrogen公司)，胎牛血清(四季青公司)，AnnexinⅴPI细胞凋亡检测试剂盒、蛋白定量试剂盒、蛋白Marker及ECL发光试剂盒(凯基公司)，青链霉素、胰酶(吉诺公司)，荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa公司)，引物均由上海英俊生物技术有限公司合成。survivin抗体(Santa Cruz公司)。内参βactin、辣根过氧化物标记二抗
(北京中山公司)。细胞购于生科院细胞所。顺铂为山东齐鲁制药厂。
　　 方法
　　 细胞培养 HCT116细胞用DMEM培养液(含10%胎牛血清，100 U/L青霉素,100 U/L链霉素),于37℃、5% CO2培养箱中培养。
　　 AnnexinⅤPI检测细胞凋亡 收集1×105细胞PBS洗涤2次，以200 μl的Binding Buffer悬浮细胞;加入5 μl AnnexinⅴFITC混匀，加入5 μl PI混匀。室温避光15 min，流式细胞仪检测。
　　 Trizol提取细胞的总RNA 6孔培养板每孔中加入1 ml的Trizol裂解细胞，反复吹打3 ml的EP管内。静置5 min，每1 ml***仿，盖紧样品管盖，用力摇晃EP管15 s并将其置于室温下孵育5 min。4℃ 4 200 r/min冷冻离心15 min。将水样层移至一干净的EP管中，加入等体积的异丙醇，混合后将样品在冰盒上放置30 min使RNA析出，4℃ 4 200 r/min的离心力高速冷冻离