文档介绍：冰冻切片制作及染色过程中常见问题及处理
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问题思考
组织是否足够新鲜？1w以内？
灌注固定液、洗液PH值、离子浓度是否适宜？
一抗是选择途径，滴度如何确定的？
是否阅读过DATASHEET? 保存，有效期，reactivity, Cross-Reactivity ？
对该蛋白表达和分布有无预期的估计和了解?
是否设了阳性和阴性对照？
是否排除了自发荧光？
是不是判读正确？
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一、冰冻切片的优缺点
优点：
简便，快速，用时短
可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋
组织变化不大
能很好保存脂肪，类脂
能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类
对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜外表抗原和水解酶保存较好。
缺点：
不容易做连续切片
组织不能过大-不容易冻结或者组织冻结不均
不容易制作较薄的切片
冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态构造及抗原物质的定位
组织构造不如石蜡切片清晰，但是满足科研的要求
针对其缺点要注意操作条件优化，防止错误
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二、切片制作过程中几个关键步骤
1. 动物取材
2. 组织固定
3. 切片制作
4. 切片染色
好的切片制作和染色成功的关键
细节决定成败
固定、漂洗溶液PH值，成分；切片厚度、手感；抗体效价、特异性；切片孵育时间，湿度、温度；
切片判读正确-反映真实的科学现象
知识构造背景
组织学构造的熟悉……
认识病理改变：炎细胞侵润、坏死、水肿、蛋白变性、纤维化、增生、凋亡……
审美观、拍照角度、视野、曝光时间、比照度……
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常规HE染色
特殊染色
如：Masson(Thichrome staining)，油红O，尼氏染色，台盼蓝〔肥大细胞〕染色
免疫染色(immunol staining)
免疫荧光(immunol fluorescence)
免疫组化(immunol histochemistry)
依据科学研究的需要选择方法
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1. 动物取材：一定要注意“平行性〞
1 Control
6 Control
2 Control
3 Control
4 Control
5 Control
1 sham
6 sham
2 sham
3 sham
4 sham
5 sham
1 I/R
6 I/R
2 I/R
3 I/R
4 I/R
5 I/R
1 I/R+treatment
2 I/R+treatment
3 I/R+treatment
4 I/R+treatment
5 I/R+treatment
6 I/R+treatment
预实验时早发现趋势而不被误导，减少无效率的工作量
减少不同组间baseline的影响，便于不同批次实验组间比较〔背景，抗体效价，环境条件对染色影响〕
发表、修改文章图的一致性
横向
纵向
横向“block〞
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举例：不同实验时间和条件下同种一染色方法结果差异
A B C
Masson staining
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2. 标本固定应充分
固定的标准
切片冰晶少，细胞挤压变形小，切片完整，染色清晰
一般较多采用组织固定后再行切片
浸入法和灌注法
浸入法：活检、手术标本，不能进展灌注的组织固定
灌注法：动物实验研究
固定剂种类：醛类、非醛类、***及醇类
中性缓冲液配制多种聚甲醛较为常用
组织固定时
固定液要有足够的量(固定液是组织体积的8-10倍)
保持一定时间，快速灌注固定后，一样的固定剂再固定2-4h〔 4℃冰箱〕
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减少冰晶的形成
公认：未经固定的组织切片冰晶较多
固定后的组织切片仍然会有一定的冰晶，为防止冰晶的形成
采取如下方法
速冻法：将组织置入低温环境，使组织骤然降温
利用高渗溶液吸收组织水分子：将组织置于20% —30%的蔗糖溶液中，置4摄氏度冰箱足够时间〔多长时间? 判定？〕
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3. 切片：组织新鲜非陈旧标本是成败首要因素
低温恒冷箱冰冻切片法
组织快速冷冻到一定的硬度(机器要预冷)
选择不同的冷冻度
根据不同的组织而定
未经固定的脑组织、肝组织：-10- -15℃左右
甲状腺、脾、肾、肌肉等组织：-15～20℃
含脂肪组织，-25℃左右
含大量的脂肪 -30℃
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