文档介绍：细菌 DNA 提取方案细菌 DNA 提取方案:革兰氏阴性菌,如 ,一般有三种可以选择的方法。一、水煮模板法——主要用于 PCR 反应 1 、接种单菌落于 LB 或脑心平板,连续画线, 37 摄氏度培养 18 - 24 小时。 2 、刮取 1~2 接种环菌苔加入 150 微升三蒸水中,混匀, 100 摄氏度煮沸 10 分钟。 3、 12000 转/ 分钟离心 10 分钟,取上清,- 20 摄氏度保存备用。操作最简便,对试剂条件要求低。缺点是纯度不够高,可能会含有 RNA 、蛋白等杂质。但是作为一般检测目的的 PCR 反应模板已经足够了。有人称扩增 4kb 以下片段都可用此种方法制取模版,编者用此类模板 PCR 可以扩增到 3500bp 的片段。编者建议:此法得到的模版保存时间短,强烈建议每月重新制作一次。二、 CTAB/NaCl 法 1 、接种一单菌落于 5mlLB 中,30 ℃培养过夜, 2 、取 1ml 种子培养液接入 100ml2%LB 中,37 ℃、 220r/min 培养 16 小时; 3、 5000r/min 离心 10 分钟, 弃去上清。 4 、加入 10mlTE 离心洗涤后,用 10mlTE 溶解菌体, 混匀,-20 ℃保存备用。 5 、取 菌悬液, 加入 184 μ l10%SDS, 混匀, 加入 37 μ l10mg/ml 蛋白酶 K, 混匀,37 ℃温育 1 小时 6 、加入 740 μ l5mol/LNaCl, 再加入 512 μ lCTAB/NaCl, 混匀,65 ℃温育 10 分钟。 7 、加入等体积的***仿/ 异戊醇, 混匀,10000r/min 离心 5 分钟, 保留上清。 8 、上清中加入等体积的酚∶***仿∶异戊醇(25 ∶ 24 ∶ 1), 混匀,10000r/min 离心 5 分钟, 保留上清。 9 、加入 倍的异丙醇, 混匀,10000r/min 离心 5 分钟, 收集 DNA 沉淀,用 70% 乙醇离心洗涤 DNA 沉淀。 10 、用 1mlTE 溶解 DNA, 加入终浓度为 20 μ g/mlRNaseA,4 ℃保存。 CTAB/NaCl 法提取的 DNA 纯度较高,蛋白杂质较少,保存时间长,编者更喜欢把终浓度为 20 μ g/ml Rnase A 加在第5 步温育的时候, 这样最后没有 Rnase A 污染。每一步操作细致一些, 得到的 DN A 可用于 Southern blot 。编者建议:长时间保存 DNA 可放于-20 ℃,但要尽量减少反复冻融,否则影响 DNA 质量。三、盐析法 1、 对数期菌液 2、 12000rpm 30 s3、 200ul 裂解液(同 CTAB/NaCl 法), 37c,1hr 4、 66ul 5M NaCL, 混匀充分, 12000rpm 10min 5 、上清用粗枪头取至新管 6 、等体积酚充分混匀, 12000rpm 3min ,反复抽提至无蛋白层 7 、取水层,等体积***仿混匀, 12000rpm 3min 8 、上清至新管, 2 倍体积预冷无水乙醇 9、-20C , 20min , 14000rpm , 15min 10 、 400ul 70% 冷乙醇洗涤 11 、干燥, 100ul 20ug/ml RNaseA , 37C