细胞凋亡检测方法.docx

文档介绍：细胞凋亡检测方法
一、细胞凋亡的形态学检测
1光学显微镜和倒置显微镜
（1） 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，全面皱缩，细胞膜完整但出现发泡现 象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体，凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。贴壁细胞出现 皱缩、变圆、脱落。
（2） 染色细胞：
姬姆萨（Giemsa）染色、瑞氏染色等：正常细胞核色泽均一；凋亡细胞染色质浓缩、 边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态；坏死细胞染色浅或没 染上颜色。
苏木素-伊红（HE）染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色（凋亡细胞）， 正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失。
2荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜
一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。
常用的DNA特异性染料有：Hoechst 33342, Hoechst 33258, DAPI„三种染料与DNA 的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。
Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大细胞毒 作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。
DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。
PI和Hoechst33342双标：PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA （或RNA）结合。但 PI不能通过正常细胞膜，Hoechst则为膜通透性荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时 细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但 是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的 核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或 核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。
凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期： I期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased）,部分染色质出现浓缩状态；Ila 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；lib期的细胞核裂解为碎块，
control
stage I
control
产生凋亡小体（图1）。
stage Ila
stage Ila
stage lib
pro-apoptosis nuclei （I 期）
图2电子显微镜观察Jurkat细胞凋亡过程中 核染色质的形态学改变
DAPI染色
图1 HeLa细胞凋亡过程中核染色质的形态学变化
3透射电子显微镜观察
凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡I期（pro-apoptosisnuclei）的细胞核内染色质 高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构（图2）； Ila期细胞核的染色质 高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。
二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）
磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜