文档介绍：本科学生综合性实验报告姓名: 学号: 学院: 专业、班级: 实验课程指导教师及职称开课学期至学年上学期云南师范大学教务处编印实验序号及名称:实验二、宫颈癌 HeLa 细胞培养实验时间: — 实验室:睿智三 424 一、实验目的: (一)细胞培养准备工作(清洗) 能独立地进行用于细胞培养的个中器皿的清洗与消毒,掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作,了解化学消毒法的使用方法。(二) 、培养基的配制熟练掌握 RPMI 1640 培养基的配制方法(三) 、细胞传代培养 1、熟练掌握细胞传代培养的操作方法。 2、观察外培细胞在不同时期的形态变化及生长状况。(四)、死活细胞的鉴别掌握死活细胞的鉴别原理及方法。二、仪器、材料和试剂(一)细胞培养准备工作(清洗) 1 、仪器超净工作台、干燥箱、高压锅、过滤器 2 、材料紫外灯、微孔滤膜(直径 25mm ):孔径为 3 、试剂 75% 酒精、重铬酸钾、浓硫酸、 NaOH 等(二)、培养基的配制 1、仪器超净工作台、微孔过滤器( )、高压灭菌锅、蒸馏水器、磁力搅拌器、天平、超低温冰箱、二氧化碳培养箱 2、材料细胞培养瓶、微量加样器、 250ml 和125ml 试剂瓶、量筒、离心管、 pH试纸、培养细胞 3、试剂 HCl 、NaOH 、酚红 RPMI 1640 干粉小牛血清、青霉素、链霉素、 L-谷氨酰胺 NaHCO 3、胰酶三蒸水(三)、细胞传代培养 1、仪器超净工作台、微量加样器(移液枪)、倒置显微镜、高压灭菌锅、蒸馏水器、超低温冰箱、二氧化碳培养箱 2、材料细胞培养瓶、滴管、培养细胞(四) 、死活细胞的鉴别 1、材料: HeLa 细胞株 2 、试剂: % 台盼蓝溶液(生理盐水配制 why ?) 三、实验原理、装置示意图: (一)细胞培养准备工作(清洗) 清洗与消毒是组织培养实验的第一步,是组织培养中工作量最大,也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌操作的要求程度很高。细胞培养不好与清洗不彻底有很大关系。灭菌手段的选择也十分重要,对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对,即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。(二) 、培养基的配制组织培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售,它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。小牛血清含有一定的营养成分,更重要的是它含有细胞生长所必需的生长因子、激素、贴附因子等,是合成培养基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质的毒性。(三)、细胞传代培养细胞传代培养:当原代培养细胞或细胞系细胞增殖达到一定密度后(一般形成致密单层),则需要再做培养。即将培养的细胞分散后,以适当比例转移到另一个或几个容器中扩大培养,此过程为传代培养。一般将传代培养的积累次数作为传代细胞的代数。贴壁细胞指的是体外培养条件下,必须贴附于支持物表面才能生长的细胞,贴壁后一般呈纤维样细胞或上皮样细胞两种形态。贴壁细胞在培养瓶长成致密单层厚,继续生长的空间不足,培养基中的营养成分也消耗较多,同时代谢废物也有较多堆积,需进行分瓶培养,对细胞进行传代扩增。对于贴壁不太紧的细胞如 colo320 ,可以直接吹散后分瓶。而对于贴壁较紧的细胞如 HeLa 、 colo205 贴壁细胞,则需要以细胞消化液消化后才能脱落和分散。常用的消化液为胰蛋白酶。胰酶消化的原理:胰酶是一种蛋白酶,通过特定位置上降解蛋白,使细胞膜上和培养瓶壁结合处蛋白降解,致使两者分离。这时细胞由于自身内部细胞骨架的张力以及培养液表面张力作用下成为球形。细胞消化用胰蛋白酶常用的工作液浓度为 % , PH 为 - 之间。胰酶消化的程度是一个关键:消化过度会对细胞活性损伤较大,并有部分细胞漂浮,随弃去的胰酶流失,甚至造成细胞破碎;消化不足则细胞难于从瓶壁吹下,反复吹打同样也会损伤细胞活性。一般消化时间为 1至3分钟,肉眼观察瓶壁由半透明转为点状透明时,弃去胰酶,并加入适量的有血清培养液终止消化,吹打分散。(四)、死活细胞的鉴别细胞的存活率是反映细胞群体生活状态的重要指标。多种方法可以鉴别细胞的死活,最常用到的方法是染色排除法。其原理是:许多酸性物质不容易穿过活细胞的质膜进入胞内, 却能渗入死亡的细胞内,使其着色,以此来区别死活细胞。四、实验方法、步骤、现象及注意事项: (一)细胞培养准备工作(清洗) 1、清洗 1)新玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗,再浸泡 5%稀盐酸中和玻璃表面的碱性物质和有害物质。 2)使用过的玻璃器皿的清洗(