文档介绍：生物化学实验 Biochemical Experiment 实验成绩评分方法?实验预****情况( 10% ) ?实验操作情况( 30% ) ?实验报告情况( 30% ) ?实验考试成绩( 20% ) ?实验素质(遵守实验室规则和道德行为) ( 10% ) 本学期实验课安排本学期实验课安排 9月11日 9月18日 9月25日 10月9日 10月16 日 10月23 日 10月30 日 11月6日生化实验常规仪器的使用 4 学时蛋白质的盐析分级分离及凝胶层析脱盐 6学时醋酸纤维膜电泳鉴定蛋白质 6 学时蛋白质含量的测定(考马斯亮蓝法和 Fulin 酚法) 8学时蛋白质等电点的测定-等电聚焦 8 学时丹磺酰化分析蛋白质 N- 末端氨基酸 I 6 学时丹磺酰化分析蛋白质 N- 末端氨基酸 II 6 学时猪肝 DNA 的制备 6 学时 11月13日 11月20日 11月27日 12月4日 12月11日 12月18日 12月25日 2007 年1月 DNA 定量和纯度测定 6 学时 DNA 变形和复性以及 Tm 值得测定 6 学时蔗糖酶的制备及各步比活力的测定 8 学时底物浓度对酶活性的影响及 km 值测定 8 学时正交法寻找蔗糖酶的最适反应条件 8 学时氨基转换反应的定性鉴定 6 学时 LDH 在不同组织中的表达分析-非变性聚丙烯酰***凝胶电泳 10学时综合设计实验(考试) 6 学时有关网址和参考书目? ebio/biochem_ ? chemistry/bioc8 00/ ? /~cmg/ ?/ ?赵永芳. . ? 2、蛋白质的盐析分离和凝胶层析脱盐 2、蛋白质的盐析分离和凝胶层析脱盐?蛋白质的盐析分级分离? SephadexG-25 脱盐?盐离子的跟踪检测?UV检测蛋白质蛋白质提取、分离、纯化及鉴定技术蛋白质提取、分离、纯化及鉴定技术?材料(取材一定要新鲜,在低温下操作) ?破细胞(匀浆器,研钵,超声波,反复冻融,化学方法,酶解等) ?蛋白质提取(根据物质的性质,水、盐溶液、稀酸、稀碱、有机溶剂) ?蛋白质分级分离(盐析分级分离、有机溶剂分级分离、等电点分离) ?进一步纯化(透析、柱层析:分子筛、离子交换、亲和层析、 HPLC ) ?鉴定(电泳:薄层电泳(纸, NC 膜)、凝胶电泳( PAG ,琼脂,淀粉);结构分析;活性分析;呈色反应) ?含量测定( fonlin 酚法、考马斯亮蓝 G250 法) 蛋白质的分级分离(粗分级) 蛋白质的分级分离(粗分级) 一、盐析沉淀分离 1、盐溶和盐析现象:低盐浓度下蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而增加;盐浓度升高到一定程度后,蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而减小析出。 2、盐的选择:通常采用中性盐,硫酸铵、硫酸镁、***化钠、磷酸钠等。 3、硫酸铵浓度的计算与调整: (1)加硫酸铵饱和液: V=V 0(S 2—S 1)/(1—S 2); (2)加固体硫酸铵: t=G (S 2—S 1)/(1— AS 2) V为所加饱和硫酸铵体积; V 0为原溶液体积; S 2为需达到的硫酸铵饱和度; S 1为原溶液硫酸铵饱和度; G和A为常数, 0 ?时G为 507 , A为 ; 20 ?时, G为 533 ,A为 。t为每升加入的克数。二、有机溶剂沉淀分离有机溶剂沉淀出的蛋白质沉淀比盐析沉淀出的蛋白质沉淀易于过滤或离心分离,分辨率好,但容易使蛋白质变性,通常在低温下进行。三、选择性沉淀法(等电点、热变性、酸碱变性等) 四、吸附法五、重金属盐沉淀法蛋白质的进一步纯化(细分级) 蛋白质的进一步纯化(细分级) ?一、透析和超过滤?二、层析(色谱)分离?1、气相色谱(色谱仪) ?2、液相色谱:纸层析和薄层层析(分配层析)、柱层析(分子排阻、