文档介绍：PCR基因扩增仪专题知识
内容提要
1. PCR基因扩增仪 工作原理
PCR技术 原理及发展
PCR基因扩增仪 工作原理
2. PCR扩增仪 分类与结构
定性PCR扩增仪
实时荧光定量PCR扩增仪
3. PCR扩增仪 性能指标、操作规程
PCR扩增仪 性能指标
PCR扩增仪 操作规程
4. PCR扩增仪 应用
第一节 PCR基因扩增仪 工作原理
一、PCR技术 发展
Khorana (1971)等最早提出核酸体外扩增 设想: “经DNA变性, 与适宜 引物杂交, 用DNA聚合酶延伸引物, 并不停反复该过程便可合成tRNA基因。”
1985年, Kary Mullis在Cetus企业工作期间, 发明了PCR。Mullis要合成DNA引物来进行测序工作, 却常为没有足够多 模板DNA而烦恼。
1983年4月 一个星期五晚上, 她开车去乡下别墅 路上,猛然闪现出“多聚酶链式反应” 想法。
1985年10月25日申请了PCR 专利, 1987年7月28日同意（专利号4,683,202 ）, Mullis是第一发明人;
1985年12月20日在Science杂志上发表了第一篇PCR 学术论文, Mullis是共同作者;
1986年5月, Mullis在冷泉港试验室做专题汇报, 全世界以后开始学****PCR 方法。
聚合酶链式反应（PCR）是一个用于放大扩增特定 DN***段 分子生物学技术, 它可看作是生物体外 特殊DNA复制, PCR 最大特点, 是能将微量 DNA大幅增加。所以, 不管是化石中 古生物、历史人物 残骸, 还是几十年前***案中凶手所遗留 毛发、皮肤或血液, 只要能分离出一丁点 DNA, 就能用PCR加以放大, 进行比对。这也是“微量证据” 威力之所在。
第一节 PCR基因扩增仪 工作原理
二、PCR技术 原理
体外核酸扩增, 加热使双链DNA解开螺旋, 在退火温度条件下引物同模板DNA杂交, 在Taq DNA聚合酶, dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸), Mg2+和适宜pH缓冲液存在条件下延伸引物, 反复 “变性→退火→引物延伸”过程至25-40个循环, 呈指数级扩大待测样本中 核酸拷贝数。
简单 说, PCR仪就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内 大量合成, 基础上它是利用DNA聚合酶进行专一性 连锁复制。现在常见 技术, 能够将一段基因复制为原来 一百亿至一千亿倍。
第一节 PCR基因扩增仪 工作原理
模板DNA 变性: 模板DNA经加热至93℃左右一定时间后, 使模板DNA双链或经PCR扩增形成 双链DNA解离, 使之成为单链, 方便它与引物结合, 为下轮反应作准备
模板DNA与引物 退火(复性): 模板DNA经加热变性成单链后, 温度降至55℃左右, 引物与模板DNA单链 互补序列配对结合;
DNA模板与引物结合物在TaqDNA聚合酶 作用下, 以dNTP为反应原料, 靶序列为模板, 按碱基配对与半保留复制原理, 合成一条新 与模板DNA链互补 半保留复制链
反复循环变性--退火--延伸三过程, 就可取得更多 “半保留复制链”, 而且这种新链又可成为下次循环 模板。每完成一个循环需2～4分钟, 2～3小时就能将待扩目 基因扩增放大几百万倍
第一节 PCR基因扩增仪 工作原理
PCR基因扩增仪 工作关键
DNA聚合酶在高温时会失活, 所以, 每次循环都得加入新 DNA聚合酶, 不仅操作烦琐, 而且价格昂贵, 制约了PCR技术 应用和发展。
从PCR反应基础原理能够看出, PCR基因扩增仪工作关键是温度控制。
第一节 PCR基因扩增仪 工作原理
第二节 PCR扩增仪 分类与结构
第二节 PCR扩增仪 分类与结构
荧光实时定量PCR（real-time quantitative PCR,RQ-PCR）技术
在PCR反应体系中加入特异性 荧光染料或探针
荧光信号 改变真实地反应了体系中模板 增加
经过检测荧光信号, 从而实时监测整个PCR反应过程
最终经过标准曲线对未知模板进行定量分析
第二节 PCR扩增仪 分类与结构
实时荧光定量PCR仪
金属板式实时定量PCR仪
离心式实时定量PCR仪
各孔独立控温的定量PCR仪