文档介绍：?一般多肽类药物,如胸腺肽,转移因子等由动物脏器提取而来,其检验方法与第八章蛋白质的方法基本相同。这里仅就通过基因重组而得到的多肽类药物加以叙述。基因重组多肽因子类药物的鉴别主要采用 SDS- 聚丙烯酰***电泳法和免疫印迹法。? SDS- 聚丙烯酰***电泳法 SDS 是一种阴离子表面活性剂,能打断蛋白质的非共价键使其成为组成它们的多肽链,并按一定的比例和解聚后的蛋白质分子结合成复合物,使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷,掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此,各种蛋白质 SDS 复合物在电泳时的迁移率, 不再受原有电荷和分子形状的影响,而主要取决于蛋白质及其亚基分子量大小。这种电泳方法称为 SDS 聚丙烯酰***凝胶电泳(简称 SDS — PAGE) 。用 SDS-PAGE 鉴别生物样品必须是该品有极纯的标准对照品,通过电泳结果的对比,确定所测样品是否与标准品有相同的迁移率,从而鉴别该品。?缺点:必须有标准品,而实际工作中获得生物标准品是十分困难的; 凝胶中多肽需保留生物活性,或能够复性,或电泳前可将检测配基与待测多肽共价交联。?免疫印迹法(又称转移电泳,蛋白印迹法, western blot ) 原理: 借助聚丙烯酰***凝胶技术,将生物活性物质高效分离,分离后的样品可以原位、定量驱动或吸印在另一种固相载体(通常用醋酸纤维素薄膜,简称 NC 膜) 上,能保持原有的生物活性,可以进行各种生物检测、免疫识别、扫描、积分和保存。基本操作分3个部分: 聚丙烯酰***凝胶电泳;转移电泳即将凝胶中的多肽条带转移到***纤维素纸上; 检测或鉴定薄膜上的多肽条带。①聚丙烯酰***凝胶电泳先将待分离样品进行凝胶电泳分离。凝胶可用琼脂糖凝胶,也可用聚丙烯酰***凝胶,可以是均一的,也可用梯度凝胶,凝胶缓冲体系中可含有各种变性剂,如 SDS 、 LDS 、尿素等,可进行单向或双向电泳,也可用等电聚焦电泳。②转移电泳将湿醋酸纤维素( NC )薄膜紧贴凝胶,凝胶与薄膜之间不能有气泡,否则在气泡所在部位的条带将不能转移,在 NC 膜和凝胶的另一侧放上两层湿滤纸,也不能有气泡,再在两边贴上海绵,最后用塑料网框架夹紧,插入电泳槽,根据凝胶中样品所带电荷的性质, 决定有 NC 膜的一边是靠近正极还是靠近负极一侧。电泳条件取决于凝胶类型、转移装置和蛋白质本身性质等。一般采用低电压和低电流( 2mA/cm 2以内)。缓冲液中一般含有 20 %的甲醇或乙醇,其作用主要是保持凝胶的几何形状。③检测或鉴定 NC 膜借助非共价键吸附蛋白质,经转移后蛋白质条带就固定在 NC 膜上, 完全保留凝胶中的蛋白谱,可直接用考马斯亮蓝、氨基黑 10B 等染色。如果利用蛋白质生物活性,或用蛋白质生物探针来检测,就要先用1%~ 3%的牛血清蛋白或血红蛋白,或非离子去垢剂( %吐温-20 )等处理 NC 纸,以封闭 NC 纸上未吸附蛋白质区域,使其不再能吸附蛋白质。使用非离子去垢剂比较经济,但有可能把 NC 纸上的某些蛋白质洗掉,同时还要将 NC 纸反复洗涤以去除变性剂,使蛋白质恢复到天然态或生物活性,然后再与检测探针保温。如用 Con A (伴刀豆球蛋白 A)检测糖蛋白,用抗体检测其特异性的抗原,用激素检测其特异受体,用底物检测特异的酶等。如探针本身具有放射性(如 125 I标志 Con A ),或连有酶(如酶标抗