文档介绍：一、RT-PCR
1、RNA浓度的测定：µl上核酸浓度检测仪
RNA
检测值
1
2
3
4
均值
492
RNA浓度（ng/µl）
A260/A280
730
RNA浓度（ng/µl）
A260/A280
939
RNA浓度（ng/µl）
A260/A280
1014
RNA浓度（ng/µl）
A260/A280
LV3
RNA浓度（ng/µl）
A260/A280
2、反转录反应
（1）基因组DNA的除去反应
试剂
使用量
5×gDNAEraserBuffer
2µl
gDNAEraser
1µl
TotalRNA
最大使用1µg
RNaseFreeH2O
Upto10µl
↓
42℃2min（或室温5min，可延长至30min）
4℃
3、反转录反应
反应液配制应在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+1的量配制MasterMix，然后再分装到每个反应管中。
试剂
使用量
5×PrimerScriptBuffer2（forRealTime）
4µl
PrimerScriptRTEnzyme MixⅠ
1µl
RTPrimerMix
1µl
基因组DNA的除去反应的反应液
10µl
RNaseFreeH2O
Upto20 µl
↓
37℃15min
85℃5s
4℃
二、实时荧光定量PCR
荧光定量检测492、730、939、1014、LV3中RGN的转录水平
试剂
使用量
SYBRMix
10µl
Rox
µl
R
µl
H2O
6µl
Template
2 µl
计算机设置：
Filter520SYBR
Filter605Rox
SampleVol20
ProbeSYBRGreen
反应条件：
95℃2min
95℃15s
55℃30s40cycles
72℃30s
END→inserstep→Meltingcurve
荧光定量结果：
1 Ct
2 Ct
3 Ct
Ct均值
GAPDH NORMAL
RGN NORMAL
GAPDH 1019
RGN 1019
GAPDH 492