文档介绍：胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和活性测
一、试验目
（1）了解胰蛋白酶抑制剂制备方法;
（2）了解胰蛋白酶抑制剂抑制活性测定原理和方法;
（3）掌握离心机和微量移液器使用方法。
二、试验原理
胰蛋白酶抑制剂是对胰蛋白酶有抑制活性蛋白质。
利用蛋白质可溶于水或提取液中性质, 可用水或提取液从富含胰蛋白酶抑制剂材料中抽提胰蛋白酶抑制剂, 利用盐析使胰蛋白酶抑制剂沉淀出来, 得到含有胰蛋白酶抑制剂蛋白质制品。
在制备过程中经过测定对胰蛋白酶抑制活性进行跟踪检测。
二、试验原理
胰蛋白酶可作用于其底物苯甲酰-L精氨酰-对硝基苯***(BAPNA), 使BAPNA发生水解, 生成苯甲酰-L-精氨酸和淡茶色对硝基苯***, 使溶液变成淡茶色。
假如在此活性测定系统中加入过量胰蛋白酶抑制剂, 过量抑制剂与胰蛋白酶竞争底物, 抑制了胰蛋白酶水解活性, 不能使底物水解, 无对硝基苯***生成, 不能使溶液变成淡茶色, 而展现无色, 从而表现出胰蛋白酶抑制活性。
本试验以大豆为关键原料, 制备胰蛋白酶抑制剂, 并测定其抑制活性。
二、试验原理
BAPNA BA p-NA
三、试剂与仪器
（一）试剂
mol/L Na2HPO4, NaH 2P04。
; 36mL NaH2PO4混合, 用蒸馏水定容到500 mL。
固体硫酸铵。
2 mol/L HCI
l0mol/L NaOH。
60％乙酸溶液(v/v)。
底物缓冲液: mmol/L Tris-HCI缓冲液(内含0. 4％***化钙)。
1 mmol/L BAPNA水溶液.
20 mg/mL胰蛋白酶溶液: 用0. 001mol/L盐酸配制。
三、试剂与仪器
（二）材料与器材
新鲜材料
绞碎机
纱布
台式高速冷冻离心机
微量移液器
pH值试纸
恒温水浴锅
电子天平
玻璃试管、烧杯、量筒
离心管
四、试验方法
（一）胰蛋白酶抑制剂提取和纯化
50g大豆, 绞碎, 1: 7加水
, 4℃, 过夜
缓慢加入硫酸铵至60%饱和度
10ml, 2500rpm, 15min
, 10000rpm, 10min
弃沉淀留上清, ,
测体积V, 计算硫酸铵量
纱布过滤
留沉淀, 加入200μL dH2O
胰蛋白酶抑制剂水溶液
（1）取两支试管, 分别标识记号, 其中1号管为对照管, 2号管为测试管。
（2）根据(表2-1)表格所表示数据将溶液分别加入两支试管中。
（3）将试管中溶液摇匀, 放入28℃水浴2 min。
（4） mL 20 mg／mL胰蛋白酶溶液, 摇匀。
（5）28℃水浴5 min。
（6） mL 60％乙酸。观察现象。
四、试验方法
（二）胰蛋白酶抑制剂活性测定
五、结果与分析
说明现象
解释原因