文档介绍：核酸分离检测
一、核酸分离、提取通则
核酸在细胞中通常与多种蛋白质结合在一起。
分离标准: 确保核酸分子一级结构完整性; 排除其她分子污染。
分离与纯化方法通常包含细胞裂解、酶处理、核酸与其她生物大分子物质分离、核酸纯化等多个关键步骤。
1. 细胞裂解
机械作用: 低渗、超声、微波、冻融裂解和颗粒破碎等。不适于高分子量长链核酸分离。
化学作用: 一定p H 和变性条件下, 细胞破裂, 蛋白变性沉淀, 核酸→水相。变性条件: 加热、表面活性剂(SDS、Triton X-100 、Tween 20 、NP-40 等) 、强离子剂(异硫***酸胍、盐酸胍等) 。p H 环境: 强碱(NaOH) 或缓冲液 ( TE、STE 等)。 金属离子螯合剂( EDTA 等) 螯合Mg2+ 、Ca2+, 抑制核酸酶活性。
酶作用: 溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶)破裂细胞。降解与核酸结合蛋白质, 促进核酸分离。
联合使用: 细胞、待分离核酸类型及后续试验目。
2. 酶处理
裂解液中加入蛋白酶（蛋白酶K 或链酶蛋白酶） , 降解蛋白质; 灭活核酸酶（DNase 和RNase）
加入DNase 和RNase 去除不需要核酸。
预防核酸降解和变性
预防过酸、过碱对磷酸二酯键破坏（通常在
pH 4-10下进行） ;
避免猛烈搅拌;
预防核酸酶（DNase , RNase ）作用。
抑制DNase:
可加柠檬酸钠、EDTA等金属螯合剂; 或加去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）; 或加蛋白变性剂。
抑制RNase:
试验器皿高温, 或高压灭菌, 不能高压灭菌用
%二乙基焦碳酸盐（diethyl
pyrocarbonate, DEPC）处理。
加强蛋白变性剂如硫***酸胍、异硫***酸胍等。
加核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin）等RNase抑
制剂。
质粒DNA提取——碱裂解法
溶液I: 50 mM葡萄糖, 25 , 10 mM EDTA, pH —— Tris-Cl→ pH; 葡萄糖→大肠杆菌悬浮; EDTA →金属离子螯合剂。
溶液II: N NaOH , 1% SDS——NaOH →碱裂解细胞, 控制时间, 温柔混合 ; SDS →结合蛋白。
溶液III: 3 M 醋酸钾 , 2 M 醋酸——醋酸钾 →PDS沉淀; 醋酸→ 中和碱。
3. 核酸分离与纯化
高电荷磷酸骨架比蛋白质、多糖、脂肪等其她生物大分子物质更具亲水性。
依据理化性质差异, 选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法。
①酚提取/ 沉淀法
经典方法是酚:***仿抽提法。
裂解细胞; 离心分离含核酸水相; 等体积酚:***仿:异戊醇(25 :24 :1 体积) 混合液抽提, 漩涡振荡混匀(小分子量核酸) /颠倒混匀(高分子量核酸) , 离心分离; 疏水性蛋白质→有机相, 核酸→上层水相。
缓冲液饱和酚——蛋白变性; ***仿增加有机相比重, 预防酚流入水相; 异戊醇可降低操作过程中产生气泡, 下层界面更清楚 。
核酸盐经有机溶剂沉淀浓缩
酚、***仿抽提后用乙醇沉淀
水相加p H5. 0～5. 5, 终浓度0. 3M NaAc 或KAc （钠离子中和核酸磷酸骨架负电荷, 在酸性环境中促进核酸疏水复性）, 加2～2. 5 倍体积乙醇, 沉淀核酸。
离心搜集, 70 %乙醇漂洗核酸沉淀除盐分。
其她可用于沉淀核酸有机溶剂: 异丙醇、聚乙二醇( PEG) 等; 盐类: 10. 0mol/ L 醋酸铵、8. 0mol/ L ***化锂、***化镁和低浓度***化锌等。