文档介绍：蛋白质的颜色反应和蛋白质含量测定
一、试验目
、了解组成蛋白质基础结构单位及关键连接方法。
、了解蛋白质和一些氨基酸呈色反应原理。
、学****多个常见判定蛋白质和氨基酸方法。
、学****考马斯亮蓝法、双缩脲法测定蛋白质浓度原理和方法
二、试验关键难点
、双缩脲反应及茚三***反应试验原理
、对于双缩脲反应中碱和硫酸铜添加次序
、茚三***反应中颜色改变过程
、测定蛋白质含量试验原理、标准曲线制订
三、试验原理
、概括
蛋白质(Protein)是由很多不一样氨基酸, 根据一定次序, 经过肽键连接而成一条或多条肽链组成生物大分子。
氨基酸基础结构为:
蛋白质关键连接方法为:
不变部分
可变部分
蛋白质与氨基酸颜色反应总结
反应名称
反应基团
反应操作
反应产物及现象
用途
双缩脲反应
肽键
NaOH及CuSO4 1ml样+2ml0%NaOH+2d CuSO4
Cu –Cu—双缩脲络合物（兰紫色）
测蛋白质含量 鉴定蛋白质水解 是否完全
茚三***反应
α-氨基酸
***试剂+1ml样
兰紫色
测AA含量检验AA及蛋白质
黄色反应
苯环、Try、Tyr
1ml样+3~4d浓HNO3 观察再加NaOH，再观察
黄色硝醌酸生成
鉴定Try、Tyr
坂口反应
胍基
样1ml+5d15%NaOH+2d1% α-萘酚+6d次溴酸钠
玫瑰红色产物生成
鉴定Arg 测定Arg含量
乙醛酸反应
吲哚环
样1ml+2ml冰乙酸+浓HSO4 (沿壁且不能混匀)微热
中间生成兰紫色环
鉴定Try
偶氮反应
咪唑基
样1ml+偶氮试剂 与20%NaOH1ml
有橙色和鲜红色产物 生成
鉴定His、Tyr
醋酸铅反应
巯基、CyS CySH
%Pb(AC)2+10%NaOH+1ml样+加热后再加HCl闻其味
黑色PbS生成 臭鸡蛋味
鉴定含硫AA CyS、CySH
、双缩脲反应
双缩脲能够与碱性硫酸铜作用, 产生兰色铜-双缩脲络合物, 称为双缩脲反应。在一定浓度范围内, 反应后颜色深浅与蛋白质含量呈线性关系。蛋白质浓度越高, 体系颜色越深。反应产物在540nm处有最大光吸收。
含有两个以上肽键多肽, 含有与双缩脲相同结构特点, 也能发生双缩脲反应, 生成紫红色或蓝紫色络合物。
这是多肽定量测定关键反应。但有双缩脲反应物质不一定都是蛋白质或多肽。含有一个肽键和一个—CS—NH2, —CH2—NH2, —CRH—NH2, —CH2—NH2—CHNH2—CH2OH或—CHOHCH2NH2等基团物质也有此反应。NH3干扰此反应, 因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色络离子Cu（NH3）42+。
双缩脲法测蛋白质浓度操作简便、快速, 蛋白质浓度与光密度线性关系好, 是蛋白质浓度分析常见方法之一, 但本法缺点是灵敏度低, 蛋白质量须在1-20mg/mL测定结果较正确。在需要快速、但正确性要求不高测定中常见此法。
、茚三***反应
C
2
C
H
C
C
C
O
O
H
O
H
2
C
C
O
O
H
R
C
C
C
O
O
O
H
O
H
还原茚三***
茚三***
水合茚三***
O
NH3
R
O
+
+
+
+
H
N
H
水合茚三***
茚三***
还原茚三***
篮紫色化合物
茚三***反应, 即: 全部氨基酸及含有游离α-氨基肽与茚三***反应都产生蓝紫色物质, 只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三***反应产生黄色物质。在570nm波长下进行比色就可测定样品中氨基酸含量, 也能够在分离氨基酸时作为显色剂对氨基酸进行定性或定量分析。-丙氨酸、氨、很多一级***呈正反应。
在法医学上, 使用茚三***反应可采集嫌疑犯在犯罪现场留下来指纹。因为手汗中含有多个氨基酸, 遇茚三***后起显色反应。
、米伦氏反应（Millon反应）
苯酚及一些二羟苯衍生物中加入米伦试剂(***、亚***、******、亚******混合物)后产生白色沉淀, 可能是羟苯之亚硝基衍生物, 经变位作用变成颜色更深邻醌肟, 最终得含有稳定红色产物。含有酚基化合物都有这个反应, 故酪氨酸及含有酪氨酸蛋白质都能与米伦试剂反应。（溶液中不能含有大量无机盐、H2O2 、醇或碱, 因它们能使***变成沉淀, 中和碱时不能用HCl）
、黄色反应
含有苯环结构氨基酸, 如酪氨酸和色氨酸, 遇***后, 可被硝化成黄色物质, 该化合物在碱性溶液中深入形成橘黄色硝醌酸钠。多数蛋白质分子含有带苯环氨基酸, 所以有黄