文档介绍：试验一六SrRNA基因 PCR扩增电泳和系统发育分析
实 验 内 容
♣16S rRNA基因 PCR扩增、电泳及系统发育分析
♣染色体步移法克隆已知序列 侧翼序列
♣ 大肠杆菌β-半乳糖苷酶 诱导表示
♣ 利用SDS-PAGE分析融合蛋白 可溶性
♣ 绿色糖单胞菌 发酵及孢外酶 提取
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试验一六SrRNA基因 PCR扩增电泳和系统发育分析
16S rRNA基因 PCR扩增、电泳
及系统发育分析
窦 桂 铭
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试验一六SrRNA基因 PCR扩增电泳和系统发育分析
实 验 目
掌握PCR 原理, 增强对PCR关键性 认识;
掌握电泳技术及系统发育分析 方法, 为未来课题研究奠定基础。
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试验一六SrRNA基因 PCR扩增电泳和系统发育分析
PCR（Polymerase Chain Reaction）法, 又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术, 是一个高效快速 体外DNA聚合程序
设想—实现—改善与完善
72℃
94℃
55℃
PCR循环
PCR技术 反应原理
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试验一六SrRNA基因 PCR扩增电泳和系统发育分析
PCR技术 反应原理
DNA或RNA模板
5´
5´
待扩增DNA区域
3´
94℃ 5 min
5´
5´
55℃
退火
5´
5´
聚合
3´
3´
5´
5´
3´
循环25-30次
变性
70℃
DNA引物
DNA聚合酶
dNTPs
Mg2+（缓冲液）
1
2
①
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试验一六SrRNA基因 PCR扩增电泳和系统发育分析
5´
5 ´
目 基因
变性
加热
5 ´
5 ´
引物
退火
5 ´
5 ´
底物
延伸
5 ´
5 ´
5 ´
加热
变性
5 ´
退火 引物
2
30个循环: 230
目标DN***段达106-107
变性－退火－延伸
5 ´
5´
2
4
5 ´
5 ´
5´
5 ´
5 ´
延伸
5´
5 ´
5 ´
5 ´
5 ´
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试验一六SrRNA基因 PCR扩增电泳和系统发育分析
一个标准 PCR过程
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试验一六SrRNA基因 PCR扩增电泳和系统发育分析
核酸 凝胶电泳
基础原理
当一个分子被放置在电场中时, 它们就会以一定 速度移向合适 电极。
这种电泳分子在电场作用下 迁移速度——电泳 迁移率。
迁移率 影响原因: 电场长度、电泳分子 电荷数量、电泳分子与支持介质 摩擦系数等。
在生理条件下, 核酸分子 糖-磷酸骨架中 磷酸基团是呈离子化状态 ——叫做多聚阴离子。方向: 负→正
种类:
水平
垂直
琼脂糖
聚丙烯酰***
普通DNA
RNA
小分子量
核酸
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试验一六SrRNA基因 PCR扩增电泳和系统发育分析
二、琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖: 线性多糖聚合物、从红色海藻产物琼脂中提取而来。
加热→凝固: 网孔状 电泳介质, 密度由琼脂糖 浓度决定。
琼脂糖凝胶分辨DN***段 能力
琼脂糖凝胶分辨DN***段 范围: -50kb
凝胶浓度 线形DNA 最好分辨范围（bp）
% 1,000～30,000
% 800～12,000
% 500～10,000
% 40