文档介绍：Western Blot 快速实验攻略
一、 Western Blot 实验原理
蛋白免疫印迹 (Western Blot , WB 是将蛋白质经电泳分离后转移到膜上 ,然后利
用抗体进行检测的技术。完整的 WB 流程 ,如下图所示 ,包含样本制备、 SDS-PAGE 、转膜、抗体结合、蛋白检测等 5
个大步骤。
二、试剂准备
各类缓冲液
1 电泳缓冲液 :10xTris-Glycine-SDS 电泳缓冲液 (20319ES76 2电转缓冲
液 :Western Blot 电泳电转通用缓冲液 (20329ES03 3蛋白上样缓冲液 :5Xsds-PAGE 蛋白上样缓冲液 (20315ES05 4其他缓冲液 :PBS , TBST 2. 样本制备
1 细胞裂解液 :RIPA (20101ES60,或 20115ES60,或 20114ES60 2蛋白酶抑制
剂 :PMSF (20104ES03
1 蛋白定量试剂 :BCA 蛋白定量试剂盒 (20201ES76
1 预制胶 :4-20%梯度预制胶 , 12 孔 (36214ES10
2 蛋白 marker :三色预染蛋白分子标准 (10-245kDa (20352ES76 1
膜 (自备
2 膜上蛋白检测 :丽春红染色液 (36221ES60 3膜的封闭 :BSA , 无 IgG (36103ES25
抗体孵育
1 抗体 :内参抗体、一抗、二抗 (例 :30101ES10, 30401ES10, 34101ES60
2 检测试剂 :ECL 化学发光超敏显色试剂盒 (36208ES60
三、实验步骤
样本制备
1 融解 RIPA 裂解液 ,混匀。取适当量的裂解液 ,在使用前数分钟内加入 PMSF ,
使 PMSF 的最终浓度为 1mM 。
2 贴壁细胞 :去除培养液 ,用 PBS 、生理盐水或无血清培养液洗一遍。按照 6 孔板每孔加入 150-250μL裂解液的比例加入 裂解液。用枪吹打数下 ,使裂解液和细胞充分接触。细胞充分裂解后应无没有明显的细胞沉淀。
悬浮细胞 :离心收集细胞 ,用手指把细胞用力弹散。按照 6 孔板每孔细胞加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。再 用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后
应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多 ,必需分装成 -1 106× 个细胞 /管 ,然后 再
裂解。
组织样本 :按照每 20mg 组织加入 150-250μL裂解液的比例加入裂解液。用玻璃匀浆器匀浆 ,直至充分裂解。
3 充分裂解后 , 10000-14000g 离心 3-5