文档介绍：宏基因组学办法研究明永冰川初步实验筹划
起草人：李浩宇
宏基因组学研究方向及意义
研究：环境胁迫对集体遗传变异过程和机理。
发掘：环境应激和应答基因多态性。
探究：多态性基因功能。
实验大体环节：
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1）避免人源污染，采样器具都要高温灭菌，采样过程中要戴手套。
2） 样品迅速解决保存。有条件最佳用液氮冷冻运送，没有条件可以将装有样品容器至于干冰泡沫箱中。带回实验室之后要尽快解决，特别是固体样品，迅速用预冷缓冲液 (多为PBS)重悬，离心收集沉淀。分装成小份，冻存于液氮或者‐80 ℃ 冰箱中，避免重复冻融。
3）如果后续用间接法提取总DNA 话，此处需要收集菌体，采用方略是稀释之后差速离心，普通合用于水样。
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总DNA 提取按照解决样品方式不同划分为直接提取法和间接提取法。
直接提取法就是直接对样品进行裂解，释放其中DNA。
间接提取法则是先分离样品中微生物，后对微生物进行裂解。两种办法合用范畴不同，各自均有优缺陷。
直接提取法优缺陷：直接提取法多用在提取固体样品(如土壤、污泥、湖泊沉积物等) 总DNA 实验中。其最大长处在于得率高，在某些环境样品总DNA 提取实例中，比间接提取法高数倍至数百倍。导致这种状况最重要因素一是环境样品中存在丰富胞外DNA；二是许多微生物与基质形成复杂构造，间接提取法不易对其进行分离。在样品较贵重时多采用此法。其缺陷同样明显，所得DNA 纯度远不及间接提取法所得，基质中含腐殖质一并被保存下来，使得所得DNA 呈现黄褐色甚至黑色。
可以考虑MoBio 和EpicentreDNA提取商业试剂盒(重要用于提取土壤样品)。
间接提取法优缺陷：间接提取法则既可以用来提取固相样品总DNA 也可以用来提取液体样品总DNA。在提取液体样品 (如海水、河流等样品)总DNA 时，需要用抽滤方式浓缩。与直接提取法刚好相反，其最大长处在于提取DNA 纯度高，既使在提取固体样品微生物总DNA 时，也可以用缓冲液对收集菌体进行重复冲洗以去除表面所带杂质。其缺陷是DNA 得率低。
土壤DNA 直接提取法：
(1) 从超低温冰箱中取出保存样品 (5 g)；
(2) 于室温融化；
(3) ml CTAB 抽提缓冲液和50 μl 蛋白酶K 贮存液；
(4) 离心管于37oC 225 rpm 水平振荡30 min；
(5) mL20%SDS；
(6) 65oC 水浴2 h，每隔15 min 轻轻颠倒多次；
(7) 室温6,000g 离心10 min，收集上清液，转移至一种新50 ml 离心管中；
(8) ml ml 20%SDS，轻轻涡旋至混匀；
(9) 浸入液氮中冷冻3 min 后，于沸水中煮沸3 min；
(10) 室温6,000g 离心10 min，收集上清液，与上次上清液合并；
(11) 重复(8)、(9)、(10)一次；
(12) 将三次提取所获上清液与等体积苯酚：氯仿(1:1 v/v) 混合，摇匀后于4 ℃
12,000g 离心10 min；
(13) 将上层水相转移至一新50 ml 离心管中，加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)，
混匀后于4 ℃ 12,000g 离心10 min；
(14) 再次转移上清至一新离心管中， 倍体积异丙醇于室温沉淀1 h；
(15) 室温12,000g 离心20 min；
(16) 收集沉淀，用预冷70%乙醇洗涤沉淀；
(17) 向离心管中加入1 ml TE，于4 ℃ 放置过夜，分装保存于‐20 ℃。
实验过程中注意事项及某些技巧：
(1) 整个提取过程吹吸动作要轻柔，避免激烈震荡(试剂盒提取除外)。
(2) 用到枪头在灭菌之前最佳将头部剪掉，避免机械剪切。
(3)酚氯仿抽提时，中间相一定不要吸到，宁可多丢弃某些。
(4) 异丙醇沉淀时不要放在低温， 倍体积室温沉淀足够了。
(5) DNA 溶解时可以放在4℃ 静置过夜，次日离心取上清去除多余杂质。
(6) 水平震荡可以用左右摇晃震荡器。
水样DNA 间接提取法：
(1)抽滤方式浓缩采集到水样。
(2)采用差速离心获得水样中菌体。
(3)获得微生物后进行裂解提取。
此办法还在查证中，详细前期对样品解决办法还在整顿中。
例如：用多少水样进行浓缩，差速离心转速选取。
会不会有DNA丢失等等。
Epicentre推出了宏基因组DN