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探讨MSCs作为携带PEDF基因载体的可行性研究.doc

文档介绍：探讨MSCs作为携带PEDF基因载体的可行性研究.doc探讨MSCs作为携带PEDF基因载体的可行性研究
摘要：目的本研究采用重组色素上皮源性因子 腺病毒(Ad-PEDF)转染小鼠骨髓间充质干细胞
(MSCs)后，评估MSCs作为携带PEDF基因载体的 可行性。方法Ad-PEDF在HEK293细胞中扩增，并 纯化后。将其转染入MSCs(MSCs-PEDF),用 Western Blot和ELISA检测培养上清液中PEDF的表达。结果 用Western Blot检测细胞培养上清中的PEDF为阳性 表达。ELISA检测培养上清中PEDF浓度为78.8 + 4.8 ng/mL结论MSCs可以作为使用PEDF基因治疗肿瘤 的载体。
关键词：骨髓间充质干细胞；色素上皮衍生因子; 基因治疗；抗血管生成
血管生成是肿瘤生长和转移的必要条件［1］,因 此，抗血管生成治疗是肿瘤治疗的一个重要部分。色 素上皮衍生因子(PEDF)是已知最强的内源性血管生 成抑制因子，可通过抑制血管内皮细胞增殖、迁移及 诱导其凋亡来发挥其抗血管生成作用［2］。重组PEDF 蛋白以及病毒载体介导的PEDF基因治疗已应用于多 个实验研究，并显示出治疗前景［4］。骨髓间充质干细

胞(MSCs)作为一种新颖、有效的靶向肿瘤细胞的载 体可能为提高PEDF的治疗效果提供一种新的策略 [3]o本研究拟通过重组色素上皮源性因子腺病毒
(Ad-PEDF)转染小鼠MSCs后，从而评估MSCs作 为肿瘤基因治疗的载体的可行性。
1资料与方法
1.1细胞培养
293细胞的培养 将293细胞置于含有 10%FBS及lOOU/ml阿米卡星的DMEM培养基中，在 37°C、5%CO2, 95%湿度条件下的孵箱中培养，以 0.25%的胰蛋白酶消化，一般2〜3d传代一次。
1.1.2人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的分离及培 养取产后新鲜脐带15〜20cm,用血管钳夹紧脐带一 端，从另一端注入0.1%的胶原酶消化。将收集的消化 液体离心(1500转Anin) 3min。接种于培养瓶中，置 于孵箱中培养。
1.1.3小鼠MSCs的分离、培养及鉴定取。6〜8 周龄C57BL/6雌性小鼠，处死后在无菌条件下取股骨 和胫骨，离心后用含有10% FBS的DMEM培养基重 悬细胞，并接种于方瓶中，置于孵箱中培养。
1.2 PEDF重组腺病毒载体(Ad-PEDF)的扩增与

纯化
Ad-PEDF的扩增 将293细胞传代培养，当 其密度达到90%时，加入适量病毒上清感染细胞。约 2〜3d后出现细胞病变，待细胞几乎变圆，且有一半 细胞漂浮时，收集细胞上清液至离心管中，3000转 /min, 4°C,离心lOmin,将上清液用0.45 u m滤器过 滤，保存于-80°C o
病毒纯化 使用 Vira TrapTM Adenovirus Pu