文档介绍：一、 实验材料、仪器和试剂
材料
新鲜植物材料
仪器设备
研钵，冷冻离心机，氮气吹干装置，酶联免疫检测仪，吸水纸，恒温箱，冰箱，96孔 酶标板，可调微量液体加样器(10 u L, 40 UL, 200 UL, 1000 PL),带盖瓷盘(内铺 湿纱布)。
试剂
包被缓冲液： g Na2CO3, g NaHCO3, g NaN3 (可不加)，用量筒加 1000 mL 蒸憎水，pH 为 。
磷酸盐缓冲液(PBS)：称取 g NaCl, g KH2PO4, g Na2HPO4 - 12H2O,用量 筒加1000 mL蒸馆水，。
样品稀释液：500 mL mL Tween-20, g明胶(稍加热溶解)。
⑷ 底物缓冲液： - H2O (柠檬酸)， - 12H2O,用量筒 加1000 mL蒸憎水溶解，再加1 mLTween-20, 。
洗涤液：lOOOmLPBS 力［1 1 mL Tween-20。
终止液：2 mol/L硫酸。
提取液：80%甲醇，内含1 mmol/L BHT(二叔丁基对甲苯酚为抗氧化剂，先用100%甲 醇溶解BHT,再配成80%的浓度。否则BHT难溶解)。
各激素包被抗原、各激素抗体、激素标准物和辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(间 接和简化间接酶免疫测定用试剂)。各激素抗体、激素标准物和各激素酶标物(直接酶 免疫测定用试剂)。
二、 实验步骤
样品中激素的提取
- g新鲜植物材料(若取样后材料不能马上测定，用液氮速冻后保存在-20°C 的低温冰箱中)，加2mL样品提取液，在冰浴下研磨成匀浆，转入10mL试管，再用2 mL提取液分次将研钵冲洗干净，一并转入试管中，摇匀后放置在4°C冰箱中。
4°C下提取4 h, 1000 g离心15 min(实验中离心机型号LDZ5-2,约4000 rpm),取上清 液。沉淀中加1 mL提取液，搅匀，置4°C下再提取1 h,离心，合并上清液并记录体积， 残渣弃去。
上清液过C-18固相萃取柱。具体步骤是：80%甲醇(ImL)平衡柱一上样一收集样品 一移开样品后用100%甲醇(5 mL)洗柱-100%乙醞(5 mL)洗柱-100%甲醇(5 mL) 洗柱」循环。
将过柱后的样品转入5 mL塑料离心管中，真空浓缩干燥或用氮气吹干，除去提取液中 的甲醇，用样品稀释液定容(-)。
样品测定
包被：在10 mL包被缓冲液中加入一定量的包被抗原(最适稀释倍数见试剂盒标签)， 混匀，在酶标板每小孔中加100 uLo然后将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘内，置
于 37°C下 3 ho
（2） 洗板：将包被好的板取出，放在室温下平衡。然后甩掉包被液，将下口瓶内的洗涤液通 过乳胶管均匀加入板上，使每孔充满洗涤液， min,再甩掉洗涤液。重复3次， 将板内残留洗涤液在吸水纸上甩干。
（3） 竞争：即加标准物、待测样和抗体。
a） 加标样及待测样： mL,内加20 PL激素的标样试剂（100 U g/mL），即为 200