文档介绍：细胞与免疫学技术 1. 实验报告、平时表现等占 20% ; 2. 操作考试:占 30% 。 3. 理论考试: (闭卷)卷面 100 分,占 50% 。题型有判断题、填图题、问答题、实验设计。实验前的准备工作—无菌操作消毒灭菌方法 1. 物理消毒灭菌法紫外线:用于空气,操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿,如塑料培养皿、培养板等 30min 湿热( 高压蒸气灭菌法): 主要应用范围是布类、橡胶制品( 如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如 Hanks 液、 PBS 等)。 121 ℃, 20mi n 干烤:主要用于玻璃器皿的灭菌, 160 ℃,2 小时过滤: μm 2. 化学消毒灭菌法 75% 酒精主要用于操作者的皮肤,操作台表面及无菌室内的壁面处理 1‰新洁尔灭主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒单克隆抗体的制备相关实验 1. 细胞的原代与传代培养 2. 细胞的冻存与复苏 的方法检测抗体 4. 双向琼脂扩散实验?原代培养可分为消化法和组织块培养法。?传代培养的目的: 当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶, 细胞才能继续生长。传代培养可获得大量细胞供实验所需。细胞培养过程中所需要的培养用液平衡盐液体?组织细胞培养中常用的基本液体,可以维持渗透压、调节 pH 值、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分?用于洗涤组织、细胞等消化液?分离组织和分散细胞?常用的有胰蛋白酶和二乙***四乙酸二钠(EDTA) 两种溶液?单独或混合使用培养细胞的结果观察? 24~ 48 小时后若培养液变成黄色且混浊,表示已被污染; ?若培养液变成紫色,一般细胞生长不好,则培养液 pH 过高; ?若培养液显为橙黄、橘红且清澈,一般显示细胞生长良好。细胞冻存与复苏[ 实验原理] 细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196 度液氮中低温保存,可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来,这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且起到了细胞保种的作用。除此之外,还可以利用细胞冻存的形式来购买,寄赠,交换和运送某些细胞。冷冻保护剂的作用冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。在溶液中加入冷冻保护剂,则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合,从而降低冰点,减少冰晶的形成,并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度,使细胞免受溶质损伤,细胞得以在超低温条件下保存。如何运用“缓慢冻存,快速复苏”的原理保存细胞? ( 细胞冻存的实验步骤) ?查出四个大方格的总细胞数(X) ?算出每个大方格的细胞数: Y=X/4 ?每个大方格的体积为 V=1mm × 1mm × ==10-4ml ?制备的细胞悬液的细胞浓度( /ml)=Y × 104 × 稀释倍数 ELISA 实验原理?酶联免疫吸附测定( enzyme-linked immunosorbent assay 简称 ELISA ): 以待测抗原( 或抗体) 与酶标抗体( 或抗原) 的特异结合反应为基础, 通过酶活力测定来确定抗原(或抗体)含量。?因为结合了免疫反应和酶催化反应,所以是一种特异而又敏感的技术。间接 ELISA 此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体, 加