文档介绍：ECL 化学发光检测(jiǎn cè)试剂
ECL 化学发光检测试剂是基于Luminol 的新一代增强型化学发光底物试剂，它由辣根过氧化物酶（HRP）催化发生化学反应，发出荧光(yíngguāng)，结果可以通过X光片压片和其他显影技术展现或使用Luminometer检测。溶液A主要成分为Luminol及特制发光增强剂 。溶液B主要成分为H2O2及特殊稳定剂。
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ECL显色(xiǎn sè)原理
发光液A和B在辣根过氧化物酶（HRP）的催化作用下,鲁米诺与过氧化氢反应生成一种过氧化物，过氧化物不稳定随即分解，形成一种能发光的电子激发中间体,当后者由激发态返回至基态，就会产生荧光。在发光过程(guòchéng)中不需要消耗HRP,HRP只是起催化作用，所以只要HRP没降解失活,是可以重复加发光液的。但HRP作为一种蛋白酶,在室温放置时间过长,是会降解的；同时在发光过程(guòchéng)中有什么物质(比如显影液)污染了膜的话,也有可能灭活膜上的HRP。
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ECL化学发光
化学发光ECL Western Blotting，主要是依据检测体系中待测物浓度(nóngdù)与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理，利用仪器对体系化学发光强度的检测，而确定待测物含量的一种分析方法
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ECL化学发光
酶促反应的发光底物是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物，目前化学发光酶免疫技术中常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。也就是常常用来标记二抗的HRP和AP。
HRP的发光底物为鲁米诺或其衍生物和对-羟基苯乙酸（HPA）。
AP的发光底物为3-（2-螺旋金刚烷-4-甲氧基-4-甲基-4-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-二氧乙烷（AMPPD）和4-甲基伞形酮磷酸盐（4-MUP，荧光底物），CDP-STAR。
化学发光底物用于免疫印迹技术已有十几年的历史，目前大部分实验室做转印时都会采用(cǎiyòng)化学发光技术进行检测。
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应用(yìngyòng)及储存
ELISA
Western & Far-Western Blot
Dot Blot
Southern Blot
Northern Blot
A液和B液2-8℃避光(bì ɡuānɡ)分别保存，保质期一年。
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ECl操作(cāozuò)的基本程序如下
1、进行常规电泳、转膜、HRP标记抗体或核酸探针孵育、洗膜。 2、新鲜配制发光工作液：分别取等体积溶液A和B混合，放置使之升到室温否则会减弱荧光强度。建议立即使用工作液，室温放置数小时后仍可使用，但灵敏度略有降低。 3、用镊子取出膜，搭在滤纸上沥干洗液，但勿使膜完全干燥。将膜完全浸入并与发光工作液充分接触。 4、用镊子夹起膜，搭在滤纸上沥干发光工作液。但勿洗去发光液。 5、在X光胶片暗盒内面铺一张面积大于膜的保鲜膜。将杂交膜贴在保鲜膜上，将保鲜膜折起来完全包裹杂交膜，去除气泡和皱褶，用滤纸吸去多余的发光工作液。用胶带将覆盖杂交膜的保鲜膜固定在暗盒内， 6、在黑暗中放入X光胶片，分别曝光不同的时间如数秒到数分钟。显影冲洗(chōngxǐ)。
发光液曝露于强光下时间过久灵敏度可能略有降低，移到暗房操作可避免。
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Western blot ---ECL
早先Western Blot主要采用同位素标记
后来酶促反应比同位素安全且快速，逐渐成为Western Blot的主流检测方法。
酶促反应可以(kěyǐ)搭配不同的底物从而实现不同的显色方法：化学发光Chemiluminescent和底物显色Colormetirc/Chromogen
随着各大厂家努力开发研制灵敏度更高的发光底物，化学发光法的灵敏度已经达到pg级别，甚至还有 Femto级别的，灵敏度超过了同位素
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注意事项
注意事项： 1. ECL工作液配制过程中吸取试剂A和试剂B时务必更换Tip头，工作液新鲜配制后立即使用，放置过久会影响灵敏度。 2. 根据蛋白丰度不同曝光时间可能是数秒(shù miǎo)至数小时。 3. 曝光时间过长会使背景加深，曝光不足会导致条带模糊。 4. 如果曝光后条带不佳，可用洗膜缓冲液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL发光和曝光。 5. 应使用高质量保鲜膜。
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发光(fā ɡuānɡ)液
理想的发光液：
发光灵敏，目前一般的发光增强剂都可以将发