文档介绍：酶联免疫吸附试验;ELISA 定义: 一种酶联免疫技术。用于检测包被于固相板孔中的待测抗原(或抗体)。即用酶标记抗体,并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面,使抗原抗体反应在固相载体表面进行,用洗涤法将液相中的游离成分洗除,最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。应用学科: 免疫学(一级学科);应用免疫(二级学科);免疫学检测和诊断(二级学科) 酶联免疫吸附试验(以下简称 ELISA) :是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板) 表面,使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行,用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法,前者用于检测大分子抗原, 后者用于测定特异抗体简介自从Engval l和Perlman(1971 )首次报道建立酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays,ELISA )以来,由于 ELISA 具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点,使其得到迅速的发展和广泛应用。尽管早期的 ELISA 由于特异性不够高而妨碍了其在实际中应用的步伐,但酶联免疫吸附试验专用仪器随着方法的不断改进、材料的不断更新,尤其是采用基因工程方法制备包被抗原, 采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断 ELISA 试验,都大大提高了 ELIS A 的特异性,加之电脑化程度极高的 ELISA 检测仪的使用,使ELISA 更为简便实用和标准化,从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。如今 ELISA 方法已被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。在动物检疫方面, ELISA 在猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。基本原理 ELISA 方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合,此种结合不会改变抗体的免疫学特性,也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后,底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型,出现颜色反应。因此,可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应,颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过 ELISA 检测仪进行定量测定,这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来,使ELISA 方法成为一种既特异又敏感的检测方法。特性用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性:有高度的活性和敏感性;在室温下稳定;反应产物易于显现;能商品化生产。如今应用较多的有辣根过氧化物酶(HRP )、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等,其中以 HRP 应用最广。辣根过氧化物酶过氧化物酶( HRP )广泛分布于植物中,辣根中含量最高,从辣根中提取的称辣根过氧化物酶(HRP ),是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白(含糖量 18% ),分子量约 40000 ,约由 300 个氨基酸组成,等电点为 pH3-9 ,催化反应的最适 pH值因供氢体不同而稍有差异,一般多在 pH5左右。此酶溶于水和50% 饱和度以下的硫酸铵溶液。酶蛋白和辅基的最大吸收光谱分别为 275nm 和 403nm 。酶的纯度以 RZ表示: RZ=OD403/OD275 纯酶的 RZ多在以上,最高为。