文档介绍：摘要: 本文主要介绍了大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法. 第一天: 1. 将适合菌株(如 XL1-Blue, DH5 α) 置于 LB 或其他营养丰富的培养基上,在 37°C 下过夜培养 2. 高温灭菌大的离心瓶( 250-500ml )以备第二天摇瓶用 3. 准备几瓶灭菌水(总量约 升) , 保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用第二天 4. 转移 -1ml 过夜培养物至装有 500ml LB (或其他营养丰富的培养基)的 1-2 升摇瓶 5. 37°C 下剧烈振荡培养 2-6 小时 6. 定时监控 OD600 值(培养 1 小时后每半小时测定一次) OD600 值达到 - 时, 从摇床中取出摇瓶, 置于冰上冷却至少 15 分钟( 需要的话这种方式可以存放培养液数小时) 8. 细胞在 4°C 5000g 下离心 15 分钟, 弃上清液( 如需要, 沉淀可在 4°C的 10% 甘油中保存一两天) 9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞. 先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中( 几毫升), 然后加水稀释至离心管的 2/3 体积. 10. 照上面步骤重复离心, 小心弃去上清液 11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞 12. 离心, 弃上清液 13. 用 20ml 灭菌的、冰冷后的 10% 甘油重悬浮细胞 14. 照上面步骤离心, 小心弃去上清液(沉淀可能会很松散) 15. 用 10% 甘油重悬浮细胞至最终体积为 2-3ml 16. 将细胞按 150 μl 等份装入微量离心管,于-80 °C 保存转化方法: 1. 在冰上解冻电感受态细胞添加 1-10 μl DNA, 冰上培育约 5 分钟 2. 添加 1-3 μl DNA, 冰上培育约 5 分钟 3. 转移 DNA/ 细胞混合物至冷却后的 2mm 电穿孔容器(无泡)中 4. 加载 P1000, 准备好 300 μl LB或 2xYT 5. 对电穿孔容器进行脉冲( 200 欧姆, 25μ Fd, 千伏) (检查时间常数, 应该在 3 以上) 6. 立即添加 300 μl的 LB或 2xYT 至电穿孔容器中 7. 37°C 下培养细胞 40 分钟至 1 小时以复原 8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养高效率感受态细胞的制备注意要点摘要: 根据实验室的实际情况, 我们将其稍作修改, 做成了 GLP 文件, 但其中仍有许多可改进或需要注意的地方, 其中有一些对普通感受态效率的提高也有一定的帮助. 关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多, 最复杂的莫过于电转化, 而最简单的则是将 LB 平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的 EP 管冰箱即开始转化. 对于做克隆工作的人而言,高而稳定的感受态可减轻不少麻烦. 现在大肠杆菌转化效率最高的要数电转化, 可达到 1010, 但是操作起来比较麻烦. 要想又简单, 又能有较高的转化效率, 最好的莫过于 1990 年《 Gene 》上刊登的由 Inoue H. 等提出的高效感受态细胞的制备与转化方法. 根据实验室的实际情况, 我们将其稍作修改, 做成了 GLP 文件, 但其中仍有许多可改进或需要注意的地方, 其中有一些对普通感受态效率的提高也有一定的帮助. 1 、所用器具的洁净程度. 这一点非常重要, 是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的,